Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 118
Текст из файла (страница 118)
Ге«Ига омм 47с 739 763. Й93. Для сравнения эффективности подходов, основанных на использовании вирусного гена белка оболочки, с одной стороны, и антисмысловой РНК вЂ” с другой, клонировали кДНК белка оболочки вируса мозаики огурца (СцМН) в растениях табака в двух ориентациях, «смысловой» и «антисмысловой» (в каждом конкретном растении — одна из этих орллелгтацлгй), а затем определили чувствительность трансгенных растений к вирусной инфекции (рис. !8.6).
Геном СцМН представлен тремя отдельными одноцепочсчньсми молекулами РН К, каждая из которых кодирует определенный вирусный белок. 1п игзо одна из этих молекул — РНКЗ вЂ” подвергается процес- сингу; часть ес последовьпсльности уда;шстся и образуется 1'НК4, кодиругощая вирусный белок оболочки. Создание трансгенных растсшлй, которые синтезируют либо нормальную мРНК и вирусный белок оболочки, либо соотвстствулощую антисмысловукз РНК, включает следующие Карпзфепь Картофель, гссеоггопо сг«Ьнери Картофель, табак 3«не Табак Табак Д абак Табак !'абак Табак, июсгерна. томат Табак, огуресс Табак, Ж Ьепглотгоно Табак, томат Томат Вирус 2 мозаики арбуза Вирус жеязон мозаики кабачков Виру« козьпееой пятннетоетн папайи Внрзе Внзззс: Вирус Вирус Вирус Вирус Вирус Вирус Вирус Вирус Вирус Вирус Суммарная вирусная РНК РНК4 Выхелепне РНК4 Синтез кДНК ~;'3-Гз Гт-гт Г!еполпвя хДНК Полноразмерная хДНК Г Присоединение линкеров П:„"'.ГХ:: ~:.:: !.П П,:;,'П П Клонирование в Е ела-векторе Клонирование в И-плазм нд1 ~ ых векторах р355 РЛВС р355 ылнтнсмысловая ориентапня .Смысловая ориентация !.
Выделение РНК4. 2. Ферментативный синтез )и У((го КДНК на РН К4. 3. Присоединение ккДНКлинкерныхпоследовательностей. 4. Встраивание полноразмерной кДНК в векторы для клонирования в обеих ориентациях, н каждой из которых она находится под контролем 355-промотора вируса мозаики цветной капус- Рис. (8.6. Процедура введения кДНК белка оболочки вируса мозаики огурца в растительные клетки. РНК4, копирующую белок оболочки, вылеляют из суммарного препарата вирусной РНК и используют в качестве матрицы лля синтеза лвухцепочечной кДНК.
К КДНК присоединяют лннкерные последовательности н встраивают ее в вектор на основе Е: со)г-плазмилы. Отбирают клоны, содержащие полноразмерную кДНК, вырезают ее из Г. серы вектора н встраивают в Г)-плазмидный вектор л~ежду 35$-промотором вируса мозаики цветной капусты (р35$) н сигналом терминацин транскрипции гена малой субъединнцы рибулозобисфосфат-карбоксилазы (гКВС). Прн этом кДНК РНК4 встраивается в двух ориентациях, так что в одном случае зранскриптом является смысловая РНК н синтезируется белок оболочки, в лругом образуется !'Н К, комплементарная мРН К белка оболочки, — антисмысловая РН К. Генная инженерия растении: применение 397 Вырезание пслноразмсрпоя кДНК П:.;:::.::-:",: П ты и рсгуляторных сигнююв терминации транскрипции растительного гена малой субьсдиницы рибулозобисфосфат-карбоксилазы.
5. Регенерация отдельных трансгенных растений, в геном которых встроена кДНК в одной из двух возможных ориентаций. Для нвслсния кДНК, кодирующих смысловую (белок-кодирующукз) и антисмысловую 398 ГЛАВА 18 Левая флаикврующая восл«ло тельное Левая фланкирующая посл«до тольиг> РЫОВ !ЧР! лчо ЛМО8 Правая флаиквруюшая гко посл«ловтгсльяоьть Правая флаикируюшая послглова- тельиосп* «ДН К белка оболочки Св МУ кДНК б«лкя оболочки СвМУ Рис.
18.7. Бинарные клонирующие векторы ца основе Т>-плазмид, содержащие кДНК белка оболочки вируса мозаики огурца (симУ) в «смысловойь (А) или «антисмысловойь (о) ориентации. кДнк наход!ива пол контролем 358-промогора (л358) вируса мозаики цветной капуе!ы и сигнала терминации транскрипции>>полиалецилирсиания гена малой субьединицы рибулозобисфосфат-карбоксилазы (гй ВС). Векторы содержат также геи неомицин4>ос4отрансгйеразы (ген ХРТ), иаходяц!иися под контролем элементов регуляции транскрипции гена нопалинсинтазы (РХОБ и ЛЧОБ), гец устойчивости к спектиномицину (Брс">, правую и левук> 4>лапкируюц!Ие послеловательности Т-ДН К и сайт инициация репликации ДНК лля широкого круга хозяев (огй).
А — >? -- «смысловая> ориентация кДНК, Х -> А — «антисмысловая». РНК, в отдельные клетки табака использовали бинарную векторную систему на основе Т1- плазмид (рпс. 18.7). В трансгенных растениях„ синтезирующих белок оболочки вируса СиМУ, Вирусные частицы пс накапливались и симптомы инфекции не проявлялись независимо от титра инокулята, В отличие от этого трапсгеппые растения, синтезирующие антисмыслову>о РНК белка оболочки СиМУ, проявляли устойчивошгь только при малых концентрациях вирусных частиц в инокуляте.
Сходныс результаты были получены в лругих лабораториях, гле были созданы трапсгснныс растения, синтсзирукицис аптисмысловыо РНК-копии генов вирусных белков оболочки, и проверено, смогут ли з!и растения противостоять Вирусной инфекции. Во всех случаях растс- НИЯ НРО>!ВЛИЛИ УСГОЙЧИВОС11 К ИпфСКЦИИ, ТОЛЬ- ко сели титр используемого инокулята был мал.
Общий вывод, который можно сделать из подобных экспериментов, состоит в слепу!ощсм: антисмысловые РНК-копии генов вирусных белков оболочки обеспечивают гораздо худшую защиту трансгенных растений от вирусных инфекций, чем смысловые копии генов белков оболочки вируса. Возможно, нс стоит совсем отказывнгься от стратегии зашиты, основанной на использовании антисмысловой РНК, однако прежде чем внедрять эту методику, се необходимо значительно усовершенствовать.
Часто сельскохозяйственные культуры бывая>т подвержены нескольким вирусным инфекциям; л!обая из них может нанести ущерб растсшим и снизить урожай. В идеале трансгенныс растения должны быть устойчивы более чем к олнол!у вирусу. Чтобы достичь этой цели, для трансформации растений желтой яйцевидной тыквы (Сисигг>!!а реро) испол!к!Ова.!и бинарные векторы на основе Т>-плазмид, несущие один или несколько генов белков оболочки СИМУ, вируса желтой мозаики кабачков и вируса 2 мозаики арбуза (рис.
18.8). Трансгеипые растения, в которых экспрессировались все три гена, в лабораторных условиях были устойчивы ко всем указанным вирусам. Растения, экспрессирующие !сны белков оболочки вируса желтой мозаики кабачков и вируса 2 мозаики арбуза, были ПРОВсрены В пОлсВых услоВиях на )'стойчиВОс'!'ь к тлям — насекомым, являюшил!ся приролпым переносчиком этих вирусов в рас!ущие растения. Если в растении экспрессировались оба гсца белков оболочки, то они проявляли полную устойчивость к одновременной инфекции этими вирусами (рис. 18.9), а если наблюдалась экспрессия только одного из вирусных белков оболочки, то заражение происходило нс сразу, Генная инженерия растений: применение 399 Л ХРТП Оыз '4МУ2 Ч'МУ 2 СМн П Ф"'- П 2УМУ ЬУМУ 2 д !чрТП гуму тумуг Л тлр1 П П Рис.
18.8. А. Т-ДЕ!К, несущая ген неомицинфосфотрансферазы (МРТ П) в качестве селективноло маркера, лен 0-глюкуроллглдазы (Сл() 8) в качестве репоргерного гена, лве копии гена белка оболочки вируса 2 мозаики арбуза (Ъ'МУ2) и ген быка оболочки вируса мозаики ог!Тща (СМУ). Левая и правая фланкирующие поысдователльности Т-ДН К обозначены Л и П соответственно. Б. Конструкция, анююплчная конструкции А, но без СМ'т' и (ЧРТ П, содержащая олпу копию %'МУ2 и ген белка оболочки вируса желтой мозаики кабачков (ХЪ М!Г). Б.
Конструкция. аналогичная конструкции Б, но содержащая СМХЛ. Во вссл трех конструкциях присутствуют соответствующие промоторы и сигналы тсрминацни транскрипции. 100 80 Дикий тип тт'Му ВУМУ 2 ГМлмвлм'т' 40 0 ! 0 10 20 30 40 50 60 70 Время, суг но в конце концов все симптомы вирусной инфекции проявлялись, и растение утрачивало коммерческую ценное гь. Итак, ясно, что наиболее эффективной стратегией при выведении трансгснных растений, устойчивых ко всем основным вирусам, замедляющим их рост и развитис, яВлястся ВВсдснис В них нсскольких Гснов, детерминирующих синтез белков оболочки вирусов.
Имеются предварительные данные о том, что трансгснные растения, в которых зкспрсссиру- Рис. 18.9. Частота заболеваний трансгенных растений желтой яйцевидной тыквы и растений дикого типа в целевых условиях. Для перслачн растениям тыквы смеси вируса жщлтой мозаики кабачков (7Л'МЪ') н вируса 2 мозаики арбуза (%Млл) использояыи тлю. (По данным работы РВСЬз, Сопза1тез, 7)(о/18гйоо)оху 13: 1466 — 1473, 1995. ) и 5' я е я к И $ и йя о а ч й щм е и о. о ются вирусные гены, отличныс от генов белков оболочки (например, ген вирусных сателлитных РНК или ген репликации вируса), также оказываются в какой-то мере защищенными от вирусных инфекций, но насколько аффективными и примени мыми будут соответствующие полхолы, пока неясно. Защита растений от патогенных вирусов может осуществляться не только их «иммунизацией» генами вирусных белков, но и при участии противовирусных белков, синтезируемых сами- аЮ ГЛАНА Ь ми растениями.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
