Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 112
Текст из файла (страница 112)
Эти клетки выдерживали в темноте в течение нескольких недель, затем переносили массу трансформированных растительных клеток па другук> питательнувз среду и ипкубировали па свету, чтобы произошла регенерация целого трансгенного растения. В табл. 1?.! перечислен ряд методов трансформации однолольных растений.
Некоторыс из этих методов требуют удаления клеточной стенки с образованием п1ютопластов. Последние поддерживают в кулыуре как независимо растущие клетки или в специальной питательной среле, гле они образуют клеточные стенки; из таких клеток может быть ре>енерировапо целое растение. Кроме того, разработаны методы трансформации, позволяющие вводить клони- 3ВО ГЛЛВЛ !7 7абшла 77 Я Методы авсденняДНК в клетки растений Мезод Комментарий Использование Т1-плнзмид Бомбардировка микрочнсгицвлги Отличная высокозффективнвя система, но применима не зшя всех видов растений Используется для широкою круга рнстсннй и зкнней: простой и ггси!ев!яй метод Незффсктинный способ досгнвки ЛНК н растительные клетки Может использоваться для введения генов только в ~ ~рочоплвсгы рнсз ительных клеток, нз которых могут быль регенсрнрованы жизг!еспособные рялчсниг! Имели ограниченное применение, поскыьку единовременно иньекцию можно сделать только в оюгу клочку; мнннпуляпии мо~ут проводить только спсцинлисты ! 1римсняегся лля ввеления генов только в протоплвсч ы, из которых могут быть регснеризкзвнны жизнеспособные рясгения 11рпмснясшя лля ввез!синя юнов только в проюплв:ты.
из которых моат быть рсгснери рованы жпзнес1 ~особиыс растения Иснолкювянис векчоров цн основе вирушзв Прямое ввеленис генон в прстоплнсты рясюний Микроиньекции Элекгропорнция Слияние липосом 7айггггза 772. Генетически грансформиронанныс растения О нес Онсяницн высокая Овслницн красная Огурец Орхидея Пнпайя !'! сгун и я Пион 11олорожнол Подсолнечник Пшеница Рис Рожь ронанный ген в небольшое писло клеток растительной ткани, из которой можно рс!енерироватз* целое растение, обходясь без регенерации из п)эатаиластан.
В настаязцсс время дл51 ЛОстанки ДНК в клетки растений предпочитают использовать либо векторы на основе Т)-илазмид, либо бомбардировку микрочастицалзи (табл. 17.1). Таким способом было генетически трансформировано более 50 различных видов растений !табл. 17.2). «ружья», приводимого н действие газами, образующимися ирн сгорании пороха, сжатым воздухом или гелием. Частицы разгон!потея ло скорости 300-600 м/с и пробивают клеточную стенку и мембраны растительной клетки. При этом их плотность такова, что клетки практически не иоврежтаются. 1)оиан в клетку, ДН К, иокрывакяцая частицы, каким-та неизвестным способом интегрируется в растительную ДНК.
Метал бомбардировки микрочастицами позволяет трансформировать растения самых разных видов, в там числе оиюдольныс и хвойные, в которые не удастся ввести ДНК с помощью Ае а)заегеггилк Бамбардировку микрочастипами можно использовать такзке лля введения чужеродной ДН К н суспснзию растительных клеток. культуры клеток, мсристсматичсские ткани, незрелыс зарольиии, иротокормы, колсоптили и пыльцу широкого крута растений !Табл. 17.3). Кроме того, Бомбардировка микрочастицами Бомбардировка микрочастицами, или биолистика, — наиболее многообещающий метод нвслеиия ДНК в растительные клетки.
Золотьгс нли вольфрамовые сферические частицы диаметром 0,4 — 1,2 мкм покрывают ДНК, осажденной СаС1, сисрмидииом или полиэтилснгликолсм, и «выстреливают» ими в клетки из сисциальиога Ьнкчлжян Ьнн«н Ьятлт бобы Виноград 1возликн Горох ! 'руша Ежл сборная Ель европейская Рль кнпнлскня Желигужиое пргко Землянике Земчшной орел Кнноля Кнпусш Кн1тп:федь Киви Клюкве Кукурузн Лшук Лен Лилия Л Люцерна Моркон~ Свхнрння свекла Сахнрныи тростник Соевые бобы Сололкн Сорю Спаржа Табак Томат Гоноль Хлопок Яблони Ячмегл А гезягзодтлз Генная инженерия растений: мстолология 78! Таблги!а 77..7. Трансгенные расзсния.
полученные бомбардировкой разл ичнык растительных клеток микрочастицами'! Рястение(я) Источник кипвк Кукуруза Суспензия .аропьгшевыл клеток, НЕ ЗРЕЛ ЫС 3 ИГОЗ ИЧСС КИС ЗВРО! 1Ы Шн Незрелые зини ические зародыши, зародышевый каллус Суспензия клеток, незрелыс зигозичсслне ародыши Незрелые зигогичсскис зврольппи 7яродышевый клллус 51чмень !1шеннпв Дсрнообгхззуюшис злаки Рол,ь Мориссона Незрелыс зиготические зародыши Незрелые зиггп ические ародыши Пршокормы Суспензия злродыгпсвгях клеток Квллус Соматические 'арозгы!пи Сорго Жемчужное просо Оршзлные Банан Тополь Рль европейская и квнвдсквя ! орох О~у!аз! Бвз аз Зиготичсскис звродышн Зародышевый квллус Квллус 11олучснные ш Мьго 1яли стебля П ьшьпа К.поквв Пион Лшперна Бобы Зародышевый квллус Зш отические зяродьппи Зигогическис ззродьппи Суспензия злролышевых клеток Злродышсвыи кзллус Пыльно Х шпок Виногрвл Земляной орех Табак '> из рябо ем аоошшхе е! а1., ьоетлал лзгс, 13, ь31.
65 3, 1995. с помощью этого метода были транспортированы гены в хлоровласты и митохондрии. На поверхность микрочастиц модо!о осадип нлазмидную ДНК, растворенную в буфере. Это позволяет новь!сить часто!у трансформации пугем увеличения количества илазмидной ДНК: олнако слелует иметь в пилу, что слишком большие ее количества могут оказаться губительными ддя клетки. В трансформированных таким сзюсобом клетках, илентифицируемых но экспрессии маркерного гена, введенная ДН К зачастую экснрессируется лишь кратковременно. Е!ока чужеродная ДНК нс встроится в геном растения, она с большои вероятностью утрачивается ири делении трансформированных клеток. Как интеграция, так и экспрессия чужеродных генов может зависеть от конфигурации вектора, используемого для их введения. Например, частота трансформации повышается, если нсцользуется линейная, а не кольцевая ДНК.
Кроме того, прн бомбарлировке микро истицами высокомолекулярные 1иазмиды (> !О т. п. и.) могут фрагмсптироваться, поэтому уровснь экспрессии чужеродных генов окажется ниже, чем в случае плазмид мсныпего размера. Применение репортерных генов цри трансформации клеток растений Для нЛентнфикации трансформированных клеток необхолимо уметь обнаруживать чужеролную ДНК, ннтсзрнровавшукз в гспомную Дг! К растения. Более того, нрн исследовании си! палов регуляции транскрипции и их функций в специфических растительных тка1шх (листьях„ корнях или цветках) зачастую !!ажно уметь количественно оценивать уровень экспрессии гена, кодирующсго легко идентифицируемый нролукт.
Все это требует применения репортерных генов, которые позволяют либо проводить отбор транссрорыированных клеток, либо оценивать активность кодирусмого нми фермента. Было протестнроваью несколько разных генов, которые можно иснользоваз ь как доминантные селективныс маркеры, и генов, чей белковый продукт можно обнаружить с цомои1ью специфических методов (табл.
(7.4). Поскольку многие из репортсрных генов имеют бактериальное Происхождение, они были снабжены регулятор- ными последовательностями, обеснечивающими их экспрессию в растительных клетках. Проводя отбор по ломинантному маркеру, можно получить культуру, содержащую только трансформированные клетки. ! ак, в присутствии канамнцина выживают только клетки растений. синтезирую!них активную неомицинфосфотрансферазу.
Выбор того или иного репортерного гена диктуется характером конкретного эксперимента. Если Ркспрессия гена мешает нормальному росту растения, то его нельзя использовать как репортерный. Кроме того, по лшению экспертов-биотехноло!ов, присутствие некоторых генов и их продуктов может цриволить к 382 ГЛАВА 17 7аблкяа 17 4. Системы рспорзерных н селсктнвнглх маркерных генов растительных клеток ц Фермент Исгюзьзовввне в качестве селектнмюго мвркерного гена Иснользоввнле в качестве ренортерного геня ь Гпзсоьси цссусу посту зя Сгизгмбспцспгосп зсьсв, еис 3 к!асяс с !92 5бу — 5зб г!гньег,сгсььу р зб — н9 м В з Оьсг,! к !ъппчъап!ее у, мссбалгсп папу уасоисас ам!азу апсг диьгссбсюгахсз СКС Ргсм, Всея ля!оп, Егя.
Эксперименты по экспрессии чужеродных генов в растениях После того кзк метоликз трансформации рзстений была полностью отработана, исслеловзтели стали пытаться вводить различные рзстительные и бзктеризльные гены в ю!етки самых рззных растений. Трзнсформировзнные растения проверяли нз способность к синтезу чужеродного белка, проводили физиологические исследовзния, чтобы определить, кзк нрисугствие этого белка сказывается нз всем растении. Во многих рзнних экспериментах использовали промоторы, контролнру!ощне конститутивную экспрессию в ряде растительных клеток.
Не тзк давно были выделены и охарактеризованы рзстительные промоторы„контролируюшие экспрессию чужеролных белков в специфических клетках нз определенных стадиях роста и развития рзстения. Нзпримср, вместо сильного конститугивного 355-проыоторз вируса мозаики цветной кзпусты, функционирующего во всех рзстительных тканях в течение всей жизни рзстения, ис- Неомнцннфосфглраюфсрязя Гнгромннннфосфотрансфсрвзв Днпсярслйосгягрелуктвзя Хлорям4юннк5синяцетнлтрянсферязя 1 ентвмнцнн-яцстнлтрвнсфсрязв Нопюгннссснтязя Октопннснугтазя (1-Глюкуроннлязя Стрепзомнцннфосфотрянсферязя Фермент, обусловливающий усгойчн Л сощсферязв светляка Бвктсрняльнвя люцнферязя трсонннлепщрвзязв Металлотнонессн Н епол-Пнрувнлщнкнмят-3-фосфятсннтя Фосфннотрнцнн-яцстнлтрянсфервзя В-Гяунктозигсяза Ьляспгцнлнн Ь -лезямннязя Анетолвкютснуггязя ЬРОЛСОКСССГГНЛН1ПРНЛЯЗЯ ззгрязненику коммерческо! о продукта.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
