Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 106
Текст из файла (страница 106)
Газ н них подастся н нижнюю часть всртнкального канала. Поднимаясь, он увлекает за собой жидкость к верхней части канала — газожидкостному сспаратору, и здесь частично выходит н воздух. Более плотная лсаэрированная жидкость опускастся по другом> всртикальнолгу каналу ко дну рсактора, и процссс повторяется. Таким образом, культуральная срсда вмсстс с клстками нспрсрывно циркулирует в биорсакторс. Эрлифтныс биорсакторы бывают двух основных типов. В первом случае рсактор прелставляст собой одну емкость с цсцтралыклй трубкой, которая обсспсчиваст циркуляцию жидкости (рсакторы с внутрсннсй рсциркуляцисй) (рис.
!б.4, 1)). Во втором кульгуральная срсЛа проходит чсрсз гпдсльныс, независимые каналы (реактор с внсшнсй рециркуляцисй) (рис. 16.4, Г). Конструкция эрлифтных реакторов с нпутрсннсй рсциркуляцисй проще, но если уж реактор построен, сто объсм и скорость цирк>гляции остаются нсизмснными. Напротив, биорсактор с внспшсй рсциркуляцисй можно модифициронать и создавать разные условия фсрмснтации. Эрлифтныс биорсакторы, вообще говоря, болсс эффсктивны, чсм барботажныс колонны, особенно в случас суспснзий микроорганизмов с большой плотностью или вязкостью. Псрсмсшинанис в них более эффективно и проблсма слипания пузырьков нс столь нслика. В особенно больших эрлифтных фсрмсцтерах, таких как фсрментср на 1 500 000 л фирмы 1С1 (Лнглия), сконсгруированный для получсция бенков одноклеточных микроорганизмов, для прохождения клстками полного цикла н рсакторс трсбустся весьма значнтсльнос время.
Чтобы обеспечить их субстрашми на всс время их персмсщсния с током жидкости, субстратъ1 нволились по вссй длине реактора сразу во многих точках. Типичные крупномасштабные системы ферментации Рскомбинантныс микроорганизмы широко используются для получсния разнообразных бслковых продуктов, применяющихся в медицине (напримср, инсулина), а такжс в качссгве своего рода «фабрик» по производству имеющих коммсрчсскую ценность мстаболитов (например, антибиотиков). Белки сннзсзируются наиболее 360 ГЛЛВА гб интенсивно в период от середины экспонепциальпой фазы ло ес завершен ия, а метабол иты — в периол замеллення роста и в стационарной фазе.
Все это должно учитываться при выборе параметров яру~ шомасшабных процессов фермензвцин. Оптимизация синтеза необходимого продукта— серьезная научная проблема. Если речь идет о белках, то 7шя ес рсгпения обычно используют клонированные гены, находящиеся пол контролем сильных регулируемых промоторов. Вначале полагали, чтолля получения нужного количества продукта булет достаточно конститутивной экспрессии клонированного гена. Однако опыт показал, что при непрерывной транскрипции и трансляции клопированного гена истощаются все энергетические ресурсы клетки и ее рост замсллястся. Чтобы приурочить экспрессию клонированного гена к опрелелснной фазе роста, можно использовать механизм индукции. Для этого вначале выращивая>т клетки в оптимальных условиях ло относительно высокой плотности, а затем инлуцируют транскрипцию, либо изменяя температуру, либо лобавляя в среду тот или иной химический индуктор в зависимости от приролы промотора (например, изопропил- 1)-тиогалактопиранозид).
Двухступенчатая фсрментация в большом биореакторе (>100 л) встречается с определенными трудностями, поскольку технически очень сложно быстро повысить температуру (обычно с 30 ло 42 'С) в больпюм объеме или обеспечить быстрое и равномерное распределение химического инлуктора. Эту проблему можно решить, если исполь:ювать два сообщающихся биорсактора (Лвухступе~чатая фермецтация): клетки выращивают в ояном из них, а индукцию осуществляют в другом.
Это позволяет оптимизировать процессы роста и индукции по отдельности и увеличить количество продукта, синтезирусмого за единицу времени. Двухступенчатая ферментация в тонг) емных зрлифтных бнареикторах Штамм Е. со(1 )х(М 989, нссуший ген ДНК-лигазы Т4 пол транскрипционным контролем промотора рь н температурочувствительного репрессора с1, выращивали и инлуцировали в двухступенчатом эрлифтном биореакторе (рнс. 16.5). Гсн ДНК-лигазы был встроен в хромосомную ДНК, что снимало все проблемы, связанные с нестабильностью плазмид в холе длительной ферментации. Клетки вырашивали при 30 С в эрлифтном биореакторе с внешней рециркуляцией и рабочим объемом 10 л. В этих условиях ген ДНК-лигазы не экспресснровался. Для инлукции при 42 "С использовали эрлифтный биореактор с внешней рециркуляцисй и рабочим объемом около 5 л.
Ьиореакторы были соединены трубкой с насосом, который обеспечивал непрерывность подачи суспензия из первого биореактора во второй. Клеточную суспснзию, достигшую опрелеленной плотности„улаляли из биорсактора, глс проходила нпдукция, и подвергали дальнейшей обработке. Максимальная удельная скорость роста культуры (р„„„) составляла )~римерно 0,66 ч ' в первом биорсакторе и 0,54 ч ' во втором, что соответствовало времени удвоения 63 и 77 мин.
Свежую среду непрерывно добавляли и ферментер, 1ле росли клетки, со скоростью 2 л/ч, а из фермснтера, глс происходила инлукция, отбирали такой же объем суспснзии. Поскольку рабочис объемы биореакторов различались, клетки находились примерно 5 ч в биореакторс, где происходил рост, и 2 ч в биореакторе, где осуществлялась индукция. Различие во времени пребывания клеток в биореакторах было необходимо лля оптимизации числа клеток, выхода продукции и стабильности ДНК-лигазы. Само время пребывания клеток в разных реакторах можно варьировать изменением нх относительного рабочего объема и объема поступающих в первый биореактор питательных всщсагв.
Использованный в этой работе эрлифтный ферментср с двойной наружной рециркуляцией (рис. 16.5) позволил упростить регуляцию относительных рабочих объемов ферментеров, а также повысить гибкость системы (обеспечивать разные условия роста Лля разных популяций рскомбинантцых клеток).
При синтезе ДН К-лигазы наилучшие результаты были получены при ежеминутном поступлении примерно 33 мл клеточной суспензии из первого биореакгора во торой. Это эквивалентно всего 0,67% объема биореактора, где осуществлялась индукция„что обеспечивало практически мгновенный подъем температуры всей поступающей суспензии с 30 Промьцвленныи синтез белков прн учасгии рскомбннантных ывкроорганизллов Зб! Г!одлчз Вьо,од Подача стерильной о)хды р клеток Подача воздуха Подача воздуха Рис.
16,5. Система из двух зрлифтных биореакторов, использующаяся для температурной индукции синтеза белкового продукта. Из ферментера, в котором осуществляется культивирование при ЗП "С (сделай клетки поступают в фермснтср с температурой 42 "С (сл!рава), где происхоит индукция. У обоих биореакторов иместея двойное внешнее рсциркуляционное устройство, оснащенное задвижками. Изменяя положение залвижск, можно создавать рабочий объем, оптимальный ддя данных условий. ло 42 'С. Для поддержания роста клеток, находящихся во втором биореакторе, в экспоненпиальпой фазе в несо непрерывно добавлялось нужное количество питательных веществ в концентрированной! форме.
Это прелотвращало расщепление ДНК-лигазы протеолитическнми ферментами, которые обычно синтезируются клетками в фазе замедления и в стационарной фазе. ((ри росте в таком двухступенчатом биореакторе непрерывного действия культура !ц!амма Е. со1! (ч(М 989 может достигать плотности 4 г (сухого вещества) на 1 л.
а на долю ДНК-лигазы 1'4 может приходиться до 4% суммарного белка в клетке, что соответствует примерно 25 000 ЕД ферментативной активности на 1 г (сухого вещества). Вообще же с помо!цью описанного подхода можно синтезирова!ь примерно 100 000 ЕД 362 ГЛАВА 16 ! Колба(0,5 ) Ферментер (5 .я) Фермепгер (45 я) Феряепзяр (600 я) цеязряФугярояяяяе Осветленная куяьсуряаьняя среда Упяэтоженяе остэяшяхся кяеюк Кдмкя Разрушение Оэисгка белка АО !)аа! ферментативпой активности на 1 л культуры, т.
е. ло 4 800 О<)0 ЕД в сутки. С учетом того что после очистки фермента уровень активности уменьпзается ло 20% и что стоимость единицы активности равна примерно 0,25 лолларов, получаем, что ежедневно можно си~ пезировать количество фермента на сумму 240 О(Н) долларов Мы нс учли всех затрат на само производство белка, однако ясно и так, что прибыль от реализации ценных продуктов, полученных при непрерывной фермензацин в биорсакторах малого или среднего размера, значительно превышает затраты.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
