Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 102
Текст из файла (страница 102)
О. 1992. Вю1о81са! соп!го! о('пгоьцвйось ягЫ о!!гег Ь1!1п8 й!сь Ьу ВасИ(т ьрйаедсиь япг( ВасгИиь Яиппягеггьггс Х Арр!. Васгег(гг(. 72: 357- 369. Всйпер( Н. Е., Н. К. %Ь!!е(еу. 1981. С1опгп8 япг( схргсьыоп оГ Гйс ВасИ(иь г(гиг(л8(елгдь с!ух!а1 рго!сгп 8спе гп !',лс(гег(сЬ(а со(г'. Ргос. Фад. Асад. Всг. (IВА 78: 2893 — 2897. В!еггаг! 1.. М. !3., М. НЬг1, М. !.. ЕегЬег„ А. Т. Меггуттеа!Ьег, Р. Л. Сау1еу, К. !3.
Роььее. 199!. Сопя!гвсйоп оГ ап ппргогеб Ьасп1огтгтгь !пасс!(с(г(с соп!я(пгп8 яп !пьес!-ьрсс(бс !охш 8епе. Лгагиш 352: 85 — 88. ТЬапзЬа1в Т., Л. Н(пг!1еу, В. Вгеппсг, С. Оег, С. Вегту. 1992. Ехргсайоп о1'Гйс пюьцгй!осЫя1 !охшь о1' ВагдИиь ьрЬаегдсиь апд ВасИЙм Яиггп8гепгдь ьвЬьр. (ьгае(ель(ь Ьу гссош(йпяп! Саи!оЬас(ег спьсепгт, а гс(йс!с 1ог Ь(о!о81са! соп!го1 оГ яцвяйс !пьес! 1ягхггс. Арр(. Еггг(гогг.
(г(гсгоЬго(. 58: 905 — 910. ТТйегу 1., 1, гх(сйо1аь, К. К1рр!га, гх. Тазг!еав бе Магьас. ! 991. 5е1ссйоп о1 суапоЬяс!спя (ьо!ягсг! 1гош шпаций!о Ьгсебйпй гй!еь яь я ро!еп!1я1 Гоог( ьошсс 1ог шоьцш!о ггггтас. Арр(. г(пг(гогг. М~сго(гго(. 57: 1354--! 359. То!!!а!ь!в М.
13., !.. К. М!!1ег. 1991. 1пьсс! ргггя!уь(ь Ьу Ьясв1от(гпь-гпсг!1а!сг( схргсьь(оп оГ а пн!с псигогохш 8спс. Магоге 352: 82 — 84. Уап К(с Л., %. Н. МсОав8Ьеу, О. Е. Лойаьоп, В. !3. Вагвей, Н. вагап Мейаег!. 1990. Мссйапвш о1' птьес! гейжяггсе оГгйс гп?сгоЬга! вгьесйсЫс ВасгВиь ((гггг(гц(епь(а Вскпгя 247: 72 — 74. %оп!1 Н. А., К К. Огапабоги 199!.
Оепс!!са11у сп81пссгсг( Ьасв1огйгпьеь аь я8сп!ь Гог рсь! соп!го1. Аппи. Век (г(гаго(г(о(. 45: 69 — 87. 1'ар %. Н., Т. ТЬапаЬа!и, А. О. Рог!ег. !994. Ехргсььюп о1' пюьцш!осЫа! !охгп 8спеь ш а 8яьгясгго(я!ег( ыгя(п оГАпсу(оЬас(ег адиадст. Арр!. Епг (гоп. Ь((сгоЬ(о(. 60: 4199 — 4202. КОНТРОЛ1ЬНЫК НОПРОСЫ 1.
Каковы прсимушсства биологических инссктицндов переЛ химическими? 2. Почему токсин Вас!Иль (Ьиг(пя(епь(ь не токсичсн для человека'? 3. Какой подход вы использовали бы для илентификяцигг гена про гоксина ВасИ(иь (Лиг(гг8(ет(ь ьвбьр. г3гаг!епых? Какое практическое примснение может найти зтот ген? 4. Как выяснить, гдс локализован ген определенного протоксина: в плазмидс или в хромосомно!г ДНК В. (Ьиг(пй(еггьИ? 5. Кяк с помощью тонной инженерии можно улучшить полсзныс свойства того или иного нротоксина В. (Ьиг(ггй(епыь? б. Как, используя мстоды гснной инжснсрии, повьюить эффективность бякуловирусов как инссктицидных агснтов? 7.
Каким образом можно расширить видоспсг!Ифичност! Токсинов? 348 ГЛАВА Г5 8. Какую информацию вы можете получить„ зная, к какому классу относится тот или иной белок Сгу? 9. Как бы вы модифицировали белок Сгу, чтобы уменьшить вероятность появления насекомых, утойчивых к токсину? 10.
Почему бактерия Азг?ссасав?гг ехселатсиз являе~ся весьма привлекательным микроорганизмом для осушсствления в ней зкснрсссии генов токсинов В. ?Ииппревз?г? 11. Как рас~нирить круг насекомых, инфицируемых данным бакуловирусом? Промышленный синтез белков при участии рекомбинантных микроорганизмов Для получения коммерческих продуктов с помощью рекомбинантпых микроорганизмов необходимо сотрудничество специалистов в двух областях: молекулярных биологов и биотехпологов.
Задача молекулярных биологов заключаезся в идентификации, изучении свойств, модификации нужных генов н создании эффективных систем их экспрессии в клочках микроорганизмов, которые можно будет использовать для промьппленного синтеза соответствующею продукта, а задача биотехнологов — в обеспечении условий оптимального роста нужного рекоюбинапз ного микроорганизма с целью получения продукта с наибольшим выходом. На заре развития молекулярной биотехнологии ученые наивно ~ юлагали, 'по переход от лабораторного синтеза к промьнплснному — это вопрос простого увеличения масштаба, т. с.
условия, оптимальныс для малых объемов, будуг оптимальными и для болыпих, так что достаючно просто взять больший реактор и соответственно болыпий объем культу- ральной среды. Такое упрощенное прсдсгавлепие не соответствует действительности. Например, аэробные микроорг анизмы хорошо расгут в обычной колбе на 200 мл при аэрации ее содержимого с помсяцыо мешалки мощносп ю 300 Вт. Если просто увеличить объем «колбы» до 10 000 литров, то потребуется мешалка мощностью 15 МВт.
Ее мотор будет размером с дом, а при перемешивании выделится столько тепла, что микрсюрганизмы попросту сварятся. Этот простой пример может нс во всем убедить биотехнологов, однако онп точно знают, что проблема промышленного культивирования микроорганизмов не сводится к пропорциональному увеличению масштаба лабораторного эксперимента. Конечно, увели- чить размер реактора (биореактора, фсрментера) совершенно необходимо, посколькудля получения!О 000 л клеючной суспензии не имеет смысла использовать 50 000 отдельных колб на 200 мл. Однако помимо этого для получения максимальною выхода как в малых (от 1 ло ! 0 л), так и в больших (>1000 л) бнорсакторах необходимо оптимизировать множество параметров: температуру, рН, интенсивность и способ перемешивания культуры и — в случае аэробных организмов — концентрацию кислорода.
При этом надо иметь в виду, что как правило оптимальныс условия изменяются при каждом десятикратном увеличении объема биореактора. Есть и другие очень важные соображения. В реакторе должен поддерживаться достато шый уровень стерильности и, кроме того, необходимо создать условия, предотвращающие утечку генетически измененных микроорганизмов.
Чтобы иметь возможность быстро и легко изменять условия в ходе фермснтации, реактор лолжсп быть снаб,"кен контрольно-измерительной аппаратурой, позволяю~пей непрерывно отслеживать значения как можно большего числа параметров. Поскольку при стерилизации может изменяться состав среды (например, могут разрушаться витамины), важно убелиться в том, что он остался оптимальным для роста нужных микроорганизмов. Как правило, промышленная ферментация и очистка продукта — процессы многоступенчатые (рис.
16.1). Обычно щюцедура начинается с приготовления и стерилизации культуральной среды и оборудования. Сначала выращивают исходную культуру (5 — 10 мл), затем инкубируют ес во встряхиваемой колбе (200 — ! 000 мл), после 550 ГЛАВЛ )6 Исходная культура (5 — !О мя) ! ! Сбор биамаееы Культурдльиая среда содержащая !!редукт Клетки Реэрушеиие Зкетраквия Очистка продукта Очистка продукта Ветряхивеемая колба (200 — )000 мл) Фермеятер для посевиопт материале (~)- )00 л) Нрпмишлеииый ферме!ттер (>!ОО л) чего переносят в ферментср Лля посевного материала (!Π— !00 л) и, наконеп, в промышленный фсрмептер (1000 — 100 000 л). По завершении фермснтации клетки выделяют из культуральной среды цснтрифугированием или фильтрацией.
Если продукт локализован внутри клеток, последние разрушают, удаляют клеточные осколки и вьщеляют продукт из осветленной среды. Сскрстируеыый продукт выделяют непосредственно из среды. Рост микроорганизмов Микроорганизмы можно выращивать в фсрментере периодического Лействия, в ферментере периодического лс!сьтвия с добавлением субстрата Ряс. !6.1. Обобщенная схема процесса промышленной ферментации. Выделяемый продукт находится либо в клетках, либо в кудьтурадьпой среде„по не в обеих фракциях одновременно, так что лаяьцейшие манипуляции проводят с олной яз этих фракций. или в непрерывной куль!уре (рис. !6.2).
В первом случае микроорганизмы вырви)ивают в стерильных условиях без добавления в ходе фсрментации свежей культуральной среды. Во втором случае по ходу ферментации к культуре периодически добавляют увеличивающиеся количества питательных веществ, при этом культуральпую среду не удаляют ло окончания процесса. При непрерывной ферментации свежая культуральная среда поступает в ферментер непрерывно, и параллельно отводится такой же объем клеточной суспснзии. Во всех слу шях через среду при необходимости пролувают кислород (обычно в виде стерильного воздуха), лобавляктт пеногдситель и (сели это нужно) кислоту или основание, Промышленный синтез белков при участии рекомбннантных микроор!анизмоа 35! Время Время Периодическая культура культура, и новая, свежая культуральная среда. Если же посевным материалом служит культура, находящаяся в экспоненциальной фазе, то выраженная лат-фаза может отсутствовать и рост начнс) ся немедленно после инокуляции.
Между лаг- и экспоненциалыюй фазами есть короткий период, так называемая фаза ускорения, когда скорость роста клеток увеличивается до достижения постоянной величины. Во время экспоненциальпой фазы клетки претерпевают несколько делений, а удельная скорость роста остается постоянной.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
