Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 103
Текст из файла (страница 103)
При из- В ходе периодической ферментапии состав культуральной среды, концентраппя микроорганизмов (концентрация биомассы), химический состав клеток и количество белково! о продукта или метаболита зависят от фазы роста, клеточного метаболизма и наличия питательных веществ. Различают шесть основных фаз роста: лат-фазу, фазу ускорения, логарифмическу)о ()оя), или экспоненциальную фазу, фазу замедления, стационарную фазу и фазу отмирания (рис. ! б.З).
Обычно после инокуляции стерильной культуральной среды мгновенного увеличещия числа клеток не наблюдается. В течение какого-то периода времени, называемого лат-фазой„клетки адаптируя)тся к новым условиям другим рН нз!и концентрации питательных веществ.
В ходе такой адаптации может произойти включение каких-то новым, ранее не проявившихся путей метабслизма. Лаг-фаза наблгодается всякий раз, когда поест!ной материал получен из культуры, рост которой прекратился в результате исчерпания субстрата или ингибирования продуктом (т.
е. культуры в стационарной фазе). Продолж ятельность лаг-фазы зависит от времени, в течение которого клетки посевного материала находились в стационарной фазе, и от того, как сильно различались среда, в которой росла е л' мм м я э е. В Время Рвс. )б.З. Кривая роса бактериальной кулыурь! при периодической ферментацвн. 1 — лат-фаза, 2 — фаза ускорения, 3 — экспоненпиальпая фаза, 4 — фаза замедления,5 — стационарнаяфаза,б — фазаотмирания.
Рве. 16.2. Изменение во времени конце!прапии клеток и суб!с!рата в периодической культуре (А), периодиче- ской культуре с добавлением субстрата (Б) и в непрерывной кульзуре (В). 352 ГЛАВА )6 бытке субстрата (г!итательных не!цеста) и в отсутствие ипгибирования роста каким-либо сослинепием, присутствующим в культуральной среяс, улельпая скорость роста не занисит от концентрации суб!прага. Кривую роста при таких условиях можно описап математически, что позволяет биотсхнологам моделировать п ропесс, а затем провести его лгасштабиронанис. Прирост клеточной массы во времени г(Х/д! ранен произвелени!о увельной скорости роста р на биомассу Х: Аналогично, прирост числа клеток йЧ/д! ранен !!роизведени ю удельной скорости )г на число клеток А'. Удельная скорость р занисит от концентрации лимитирующего субстрата (источника у! лерода или азота) з, максимальной удельной скорости роста й„„„и субстратспепифичной константы К,: )! мал И 5, и К, имеют размерность концентрации (г/л или М).
Иногда вместо улсльной скорости роста использукп время удвоения, или время генерации гд = (п2/)ь Э ! о время, за которое в определенных условиях число клеток или биомасса улнаивается. Для олноклеточных микрооршнизмон вс!!и- чина Гг„г„обычно !щхолится н лиапазонс от 2, ! до 0,086 ч ', по соответствует времени удвоения нрпл!ерно от 20 мин ло 8 ч.
Когла субстрат присутстнует н избытке (т. е. при о'» К), р = р „, и достигается максимальная скорость роста культуры в экспопенпиальной фазе. Как правило, неличина К, настолько мала, что концентрация субстрата репко становится сранниь!Ой с К, но нрсмя экспоиснцисс!ьпой фазы. Например, в случае ггхс)!еггсЫа соб К, лля глюкозы равна примерно ! мг/л, а начальная концентрация глюкозы в среде обычно составляст около )О 000 мг/л. Однако н конде экспонснциальной фазы субстрата остаегся мало, и Я может стать ниже К,.
Г1ри 5 < К, быстро паступае ! Фаза замедления. Она может быть о'!снь кратковременной или даже практически незамст- ной, поскольку из-за большого числа клеток н конце экспоненпигщьной фазы субстрат может быть израсхолонан очень быстро. В рсзульзатс истощения лимитирующего субстрата (например, источника углсрола) или накопления продуктон метай!олизма, замедля!оших рост, увеличение числа клеток постепенно прекран!ается и культура персхояит н стационарную Фазу. В это время биомасса остается постоянной, олиако метаболизм часто претерненает каряинальные изменения.
Именно в этот пернод нередко синтезируются соединения (вторичные метаболиты), прелстанляющие коммерческий интерес„например антибиотики. Прололжитсльность стационарной фазы зависит от конкретною организма и условий роста. В фазе отмирания энсргстичсские запасы клеток оказынак)тся исчерпанными, и метаболизм прекращается. В большинстве промышленных процессов фермшггапик> останавливают и клетки собирают епге ло наступления фазы отмирания. Периодическая культура с добавлением субстрата В этом слу ие н ферментер периодически добавляют субстрат, а конечный пролукт собирают только по завершении процесса.
Добавление субстрата приводит к уллинению экспоненциальной и стационарной фаз и к увеличению' биомассь! и количества мстаболитов, синтсзирусмых но время стационарной фжзы (например, антибиотиков). Однако н стационарной фазе микроорганизмы часто синтезируя!т протеолитичсские ферменты (протеипазы), разрушающие все производимые имп белки. Поэтому, сели целью Фсрментации является получение белковых прояуктон, нужно оста!юлить процесс до его псрсхола н эту Фазу. Прямое измерение концентрации субстрата в ходе ферментапии часто бывает затруднено, и чтобы определить, н какой момент нужно добавить следующую порцию субстрата, приходится использовать лру! ие показатели, коррелиру!ошие с его расходованием, например количество синтезированных органических кислот„значение рН илн количество образовавшегося ОО .
Вообще говоря, ферментсры периодического лсйствия с добавлением субстрата требуют постоянного и более тщатсль- Промышленный синтез белков при участии рекомбинантпых микроор5анизмов 353 равна удельной скорости роста й: 2) = 1а0'г)гН)Ю = ц. ВЭ 5185 ного контроля, чем простые фсрментсры периодического действия, н поэтому используются реже. Но они имеют ряд преимуществ, если говорить о разработке систем получения белков с помощью рскомбинантных микроорганизмов, а потому становятся все более популярными.
Периодическое добавление субстрата к растущей культуре рскомбинантных микроорганизмов продлевает экспоненциальную фазу и отсрочивает наступление стационарной фазы, во время которой инициируются клеточные ответы на стрессов5яе воздействия, происходит синтез протеиназ и лругие изменения метаболизма, уменьшакицис выход рекомбинангного белка. Для подлерхания метаболизма клсткихозяина коли чество добав;шемого субстрата необходимо постоянно увеличила ь.
Чтобы обеспечить непрерывный синтез рекомбинаптного белка и сто стабильность, нужно тщательно контролировать процесс и добавлять субстрат (источник углерода и азота вместе с микроэлементами) сразу, как только в этом возникнет необходмость. В зависимости от генотипа микроорганизма и природы рскомбинантного белка при периоли щекой ферментации с добавлением субстрата вглхол продукта может возрасти на 25 — 1000 % по сравнению с простой периодической ферментацисй, Периодическую ферментапию с добавлением субстрата можно ис|юльзовать лля культивированияя нс только микроорганизмов, но и клеток млекопитающих и насекомых.
Это очень важно, поскольку: 1) такие культуры все шире применяются для получения белковых продуктов, имеющих медицинское значение; 2) без периодического добавления субстрата животные клетки нс очень эффективно синтезируют чужеролные белки. гтепрерыецая пул ьтп3 ра При непрерывной фермснтации стационарные условия, т.
с. условия, при которых г)Х/~й = О, обеспечиваются тем, что при постоянном объеме биореактора убыль числа клеток (удаление продукта) в точности уравновешивается их увеличением в результате полония, Говоря более формальным языком, Лля непрерывного процесса в стационарном состоянии скорость разведения )), опредсляемая как скорость притока среды Г, деленная на постоянный обьем среды 1' в биореакторе, Чтобы получить непрерывную культуру с постоянными гидродинамическими характеристиками, нужно создать условия, при которых уделы~ад скорость роста была бы ниже максимальной величины р, . Для этого нужно так отрегулировать насос, который контролирует скорость притока Е, чтобы объем культуры в биореакторе 1'полдерживался постоянным. Важнейп1ей задачей промышленной ферментации является полу ~ение максимального количества продукта при минимуме затрат.
Эту задачу можно решить, если для каждого конкретного процесса разрабатывать свою, наиболсс эффективную конструкцию фсрмснтсра. Вообще говоря, непрерывная фермептация применяется в промьпдлснных полях нс так уж часто, прежде всего потому, что ученые накопили наибольший, опыт в работе с периодическими культурами. При этом стоимость получения данного количества биомассы в фермснтсре непрерывного действия гораздо ниже, чем в фермептсре, работающем в периодическом режиме. Такое улсисвленис обусловливается следующими факторами. ° Для получения данного количества продукта с помощью непрерывной фсрментацин нужны меньшие биорсакторы, чем с помощью периодической.
° При периодической ферментации для сбора клеток, их разрушения и послсду5ощей очистки белкового продукта или метаболита, синтезированного микроорганизмом, необходимо крупногабаритное оборудование. В то же время в фсрментсре непрерывного действия синтез идет постепенно„так что и оборудование может быть не столь громозлкнм. ° Ферментер, работающий в непрерывном режиме, не простаивает, как фсрментер, периодического действия, который нужно время от времени разгружать и подготавливать к повторному использованию.
Простой биорс- 354 ГЛАВА Гб Йплл (2~чих~ От актора в связи с реллонтом, 1исткой или стерилизапией — основная причина снижения эффективности процесса. При непрерывной фермента11ии этот простои гораздо меньше. Физиологический статус большинства клеток при непрерывной ферментации одинаков, поэтому синтез происходит более согласованно. При периодической же фермептации небольшие различия во времени сбора клеток„который проводят начиная с середины экспонснциальной фазы и заканчивая ее поздним этапом, могут приводить к значительной рассОгласоВанности. Непрерывную фермеьпъпию уже использовали для промьпиленного получения белков одно1слеточных микргюрганизмов, антибиотиков и органических растворителей.
Впрочем, этот способ имеет и свои недостатки. Время ферментации в непрерывном режиме иногда составляет 500 — 1000 ч, при этом некоторые клетки могут потерять рекомбинантные плазмиды. Клетки, не несущие плазмид, обычно расходуют меньше энергии и делятся быстрее, чем те, которые содержат плазмиду, поэтому со временем Выход продукта может снижаться из-за уменьшения числа клеток, способных его синтезировать. Э1у проблему можно было бы решить, интегрировав клонированный ген в геном орщнизма хозяина. Очень трудно поддерживать стерильные условия в промышленных установках в течение долгого времени.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
