Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 91
Текст из файла (страница 91)
Таким образом, идентифициронанные )гир-ге!!ы В. )аралцсит можо использовать н качестве гибридизационных зондов для поиска гомолопзчных генов из банка клонов В. !слит!покати!и. После идентификации Вир-генов Л. !ели!в!'- гюкапит, несмотря на всю сложность гидрогеназной системы, удалось «псреместитьа ее из Ннр"-штамма В. !елиттозагигп в штамм 11нр (табл.
14.5). Растения бобов, на которых образовывали клубеньки бактерии рскомбинантного Нор+-штамма В. !елитагокасит, росли быстрее и содержали больше азота, чем растения, инокулированные Ннр -штаммом (табл. !4.5). Работы по исслелованию генов гидрогеназ нс вызвали столь большого интереса, как исследования л(Т-генов, и тем не менее они убедительно продемонстрировали целесообразность применения методов генной инженерии для паны!пения способности диазотрофных микроорганизмов стимулировать рост растений.
Теперь нужно проверить, приведет ли введение Аир-генон в геномы других лиазотрофных микроорганизмов (как несимбиотических, так и симбиотичсских) к такому же эффекту. Гидрогеназная система может применяться не только для повышения эффективности фиксации азота. Так, очищенную пшрогеназу можно использовать для преобразования и запаса- 316 ГЛАВА!4 таблица 14.5. Рост растений и ассимиляция ахша после внсления генон Лртр в Нор -пплмм К 1екттттозаптти О| ноотпольнан нонаенз рация азота О пан:нтальнал нлонталь лнчн Относнтельноо оолержлнне азота Фенозно Отоснтольнлл сухая масса расзоннн 1,00 Нор Нор' 1„00 1,52 1,00 1.15 0 Иа работы Втьзтит,зоба тоа, Ьта раз«от 4 567,14Ь, анаарь 198Ь.
ния солнечной энергии; регенерации кофакгоров, иринимаклцих участие в промышленных фсрмситативных процессах; синтеза специфических химических соединений, требуюирсго участия Н в качестве восстановителя, для удаления трития из волы, которая использовалась для охлаждения реакторов атгзмных электростанций; лля синтеза Н из органических отходов; иоззучения водоролно-кислоролных топливных ячеек. Однако, несмотря на то что уже илентифицировано и охарактеризовано более дюжины генов гилрогсназ, пока ии один из них не использовался лля крупномасштабного синтеза этих ферлрентов.
Образование клубеньков Конкуренция среди оргагщзлгов, образующих клубенькн Одна из основных задач сельскохозяйственной биотехнологии — создание с помощью методов генной инженерии штамлюв Ииго1зрат, которые повышали бы урожайность растений более эффективно, чем ириролные штаммы.
Многие имеющиеся на рынке изтаммы-инокуляты— превосходные азотфиксаторы — были созданы путем мутатенеза и иослсдуюи1его отбора, однако оии в нсдостатотзной степени стимулируют образование клубеньков на корнях растения-хозяина в условиях конкуренции с природными ипаммами йн1гобгнт, уже присутствующими в почве. И наоборот, многие ириролиыс штаммы с успехом выдерживают конкурсгшню с лабораторными штаммами, но мшюэффсктивиы в отношении фиксации азота.
Таким образом, для того чтобы можно было реально использовать имеюрцисся на рынке инокулирующис штаммы, необходимо либо повысить их способность образовывать клубеиьки, либо устранить природныс штаммы К)т(гоЬзинт. Были проведены исслелования, направленные иа оиределсиис генетической основы «конкурентоспособности» природных штаммов, с тем чтобы затем иоиьив гься ввести соответствующие гены в штаммы-ииокуляты.
Яагбипуляции с генами образования клубеньков Для идентификации генов образования клубсньков (цод-генов)вновь исиользовшш генетическую комилементацию. Нс способный образовывать клубеньки (Хоб1-) мутантный штамм )1. теИва трансформировгши банком клонов хромосомнои ДНК К. теИоб дикого типа и выделяли колоз~ии.
приобретшие способность образовывать клубсньки на корнях лкзцсрны (рис. 14.6). Стратегия заключалась в следующем. 1. С помощью частичного гидролиза ДНК К теИоб рестриктазой ЕсоК! и встраивания фрагментов длиной до 40 т. и, н. в уникальный ЕсоК1-сайт космиды р) АГК! с широким кругом хозяев был создан банк клонов хромосомной ДНК 11. теИоб дикого типа ((л1од ь). 2.
Рекомбинантные илазмилы упаковали в частицы фага ),, ввели в Е. со(й а затем исрснеслн в клетки Хос! -штамма Я. теИоб ири помощи конъюгации. Вектор содержал ген устойчивости к тстрациклииу, который можно было использовать как селективный маркер и в случае Е со(К и в случае К. теИоб. 3. После коныогации сусисизии, содержащие от 200 до 300 трансформированных клеток К теЯой, проверяли 11а способность инициирорьчтз образование клубеньков у стерильных растений люцерны. Ожилалось, что этой способностью будут облалать только транс- тещей Ыоб !пле Инфицированис Е епг! К глеб!пи Ног! Клубеньки отсутствуют образуются ь Трансформированные Ггпу'-клетки Л.
тевып' Рис. 14.6. Илентификация генов образования клубеньков й. те!!!огб ЛИК Я. те!!!ог! дико!егина вшраивакп. вкосмилу р1-АГК1 с широким кругом хозяев, упаковывакгг в пасти!Лы ф;на Х и в~од~~ в Е со!ь Банк клонов переносят из Е спй в гзой -штамм л!. те!!!ог! при помощи коньк)ганн!к растения люцерны инокулируют трансформированными В. те!!!ог! 1ходх растения, образующие корневые клубенькн, инфицированы !б те!г!ог! й!осГ', клетки которых, по-видимому„несут комплсментирующий ген образования клубеньков в составе космндного вектора Из корневых клубеньков вылелякзт трансформированные 1яойл -клетки !1.
гпе!!!огб Бактерии, сгиыулглрукгщ!ле рост растениб 317 Частичнытл гидрслиз Бгой! 'ЛЙЙ 1 1ь! ! ДД ДНК (фРагмешы -40 т. и. гь) ~~ УК Кй — РЯК.1'зЛ, БЕЙ 1 Упаковка в яастипы фюа Х СЬ Коиъюгация - — ь Выделение 'Ю и вырапгиванве л а в культуре Клубеньки лел „тг- 318 ГЛАВА 14 форманты, которые несут и экспрсссиругот гон, комплсмсгпируюц!ий дефект образованна клубсньков в клетках )1, твИоуг'. 4. Из клубсньков выделили бактерии, вызываюшис образование клубепьков, а из бактерий— вектор, несущий комплсмснтирующий ген.
Содсржашую этот гсн большую вс:тавку персклоннровали и провели дальнейший анализ. 5. Илентифицированный гсн образования клубсньков использовали в качестве зонда лля обнаружения фланкируюгцих ого участков хромосомной ДИК Я. гпе!!!огг' в гсномной библиотскс. В результате этих вссьма трудоемких зксперимснтов удалось охарактеризовать весь набор генов образования клубсньков гг. те!г!оу!. Детальныс биохимические и гснстичсскис исслсдования показали, что образование клубсньков и его регуляция —. это сложные процессы, в которых задсйспюваны продукты больш<но количества генов !примерно 20; табл.
14.6). Одни Тпблиг!и !4.6. Некаторьгс белки, кодируемыс генами образования клубанькаа йй!бой!ггт, и нх возможные функцнн Характернстнка'г Конссраатн лен, локалнзонлгг а плазмм нческой мембране, вместе с Мод В стимулирует клеточное делез гне Консермпм лен, лакал нзолан а нлазматнчсской лгембране, аместе с Модд стимулирует клеточное деление Коз гсегзнгтггссгг, локалнзоеан а наружной мембране, «нтнпсннзаза Консераатнаен, активатор трапскрнпцнн, снгпсз ког ~стнтупзгаегг Лпкатзоаан н плазматнческой мсмбраг~с, 11-кстоацн.гсннгаза Локагнзоаан а цятоплазме, аггнлпереносягцнй белок Вндаспецнфнчен, лег нлрогена за Внлоспси нфнчен, суггьфагрансфераза Коггсергьаззггзегг, локализован и плазматнческой мембране.
учасгаует асекреггнн полнсахарнла обалочкн Валяет на нннцнацню абра!ананда клубмъкое некгпорымн нпаммамп Дгапутй!та!ям !!окатнзоьап а плазмаз нчсской мембране, ацсгнлт рансфераза П-глюкозамннсннтаза Функцня нензасстпа Г.екретнруется, гемалнзнп Комгтекс с Хгк!лг, АТР-сульфурнлаза Комплекс с мог!Р, АТР-сульфурнлаза !Иезн;прансфераза Локюгнзоаан а наружной лгембране. учасгаует а секрег гни Функцня неизвестна Внласпецнфнчен 'Г Если блока ы ические нлн генегн нскне ланы не о фу пкпн н белю агсунлнукп, то ему прял нсыеакп такие же функции, как у белка с пзмаяогичной амнаокнглогнай пссзекоеьтеяьнссзью.
Разные ютзмыы йзгзгеазгггл салержю разные наборы этик белков. олово ьканссрьатнеен ознз*мсз не белок сына«наст олннакоеуге фзнкцнга з зес«аллое Лягте!ьегь !Чодд !чод в й!одС МодГЗ Р!од Е !ч'одР Хадб мог! н !чади Мад К а!аль Хсдм Модй! н гз гз'ог! Р Над!) а!ода М скп !ч асП3 збодх из этих генов высококонссрватнвны (одиыаковы у всех микроорганизмов, образующих клубсньки), другис вилоспсцифичны. Их можно сгруппировать в три отдельных класса: конссрвативныс„видоспсцифичныс и регуляторный ген лог!1«Так, ноИАВС-гены одинаковы у всех видов Иг!.о!зигт и структурно взаимозамсцясмы; у болыпинства видов они образую!.
олин опероц. Устшншлсно, гго процесс образования клубсньков включает несколько этапов. Сначала продукт конститутивно экспрсссирующсгося гена полз связывается с молекулой флавоноила, сскрстирусмого клетками корней растснияхозяина. грзгавоноиды — это растительные фснольныс соединения, структурную основу которых составляют два ароматических кольца, соединенных друг с другом трсхуглсродным мостиком.
Они выполняют в растениях разные функции, в частности гугвсчают за их пиглгснтапию и участвуют в зашитс от грибов и насекомых. Связывание флагязноидов с бслком Хгх)О— Бактерии„стимулирующие рост растсний 319 Идентификация генов образовании клубеньков Юггг8ойиггг гпИИогг' путем прямой комплементации !чу -мутантов Б. й. 1опй, %. !. Взз!йсгпа, Г.
84. АозОЬС! Да!ьге 298: 485 — 438, 1982 Когда Лонг и др. решили идентиФицировать гены образования клубепьков из ймеодгит те!г!Огч, ни одного нодобнопз гена охарактеризовано не было. П рактичсски ничего нс было извес шо о чом, каким образом множеспю генов учаспзуют в этом процсссс или какие белки они кодирузот. Прежде чем идснтифипировать гены образования клубеньков, э~ и учсныс выделили и охарактеризовали несколько мутантов К тевчои, не спезсоб~~ьзх образовывать клубеньки.
Однако эти экспсрименты не дали исследователям ключ к объяснению Функций указанных генов. г!Оэчому они попытались отобрать гены образования клубеньков„ способные колзплементировать полученных ими мутантов гс тек!огб Работа осложнялась еще и тем, что в то время банки клонов почч и всегда создавали и полдерживали в Е. Сод. Для создания банка клонов К гпе!г!Оге и его цальнейшего переноса в мучантцые штаммы и те!!!Огг, не способные образовывать клубеньки„ исследователи лля начала создали космилный вектор с широким кругом хозяев, в который можно было встраивать длинные фрагме~г|ы ДНК (прзз- Присоединение молекул флавоноида активирует белковый продукт 1чос1О, по-видимому, вызывая его конформационное изменение. Далее комплекс флавоноид — !л!ог!!з связывается с промоторным участком генов образования клубеньков, называемым иое!-блоком.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
