Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002 (947307), страница 60
Текст из файла (страница 60)
Чтобы получить от трансгенных животных клетки, сскретируюп!ие специфические моно- клональные антитела, можно использовать стандартную гибридомную технологию, затем провести скринпнг таких положительных клеточных линий н определить, какие из ! !их вырабатывают антитела, кодируемые генами иммуноглобулинов человека. Недавно появилось сообщение о том, по уже получена трансгснная мышь, экспрсссирующая нативные формы Н- и 1-цепей иммуноглобулинов человека. Трансплантация стиоловых клеток иммунной системы человека хе!дынь!шал! и получение линий трапсгснных мышей — весьма трудоемкис способы производства моноклональных антител человека. Поэтому ученые пытаются создать генноипженсрпыс мстоды получения антител человека, которые можно использовать в качестве терапевтических средств, и эффективных бифупкциональных белков, способных связываться с мишенью и разрушазь се.
Гибридные моноклональные антитела челонека и мыши Тот факт, что разные участки молекулы иммуноглобулнна выполняют разные функции, позволяет модифицировать моноклональное антитело В конце 70-х — начале 80-х гг. молекулярная биотехнология стала привлекать к себе внимание общественногли и крупных инвесторов. Одним из биотехнологических цролуктов был интсрферон, на который в то время возлагали надежды как на чудодсйсзвешюс средство против множества вирусных заболеваний и рака.
О выделении кДНК интерферона человека и его последующей экспрессии я Бс)!сгГсlиа сод сообщали газеты и журналы всего мира. Некоторые особенности интсрфероца сделали вьщелецне его кДНК особенно сложным. Во- вестцо, есть ли клетки человека, способные вырабатывать иптсрфероц в лостаточцо больших количествах, з.
е. существует ли источник л!РНК интерферона. Несмотря на всс эти трудности, в конце концов была вьщелеца и охарактеризована кДНК, колирукяцая интсрферон. С тех пор было обнаружено несколько разных типов интерферонов. Были вылслсны гснм нсскольких интерфсронов и показана их эффективность при лечении различных вирусных заболеваний, но, к сожалению, интерфсрон пс стал панацеей.
216 ГЛАВА 1О мыши таким образом, что оно приобретает некоторые сегменты аптитсла человека, сохраняя в то же время свою исходную антигенсвязывающую специфичность. Такое гибридное антитело называня химерным. Первым участком моноклонального антитела мыши, который был заменен соответствующим участком антитела человека, был Вс-фрагмент. Выбор сбьяснялся тем, что гс-фрагмент антитела мыши выполнял роль эффектора иммунного ответа у человека нелосппочно хорошо; кроме того, он с большой вероятнсялью индуцировал образование античел в организме человека.
Чтобы снизить иммуногенность и усилить зффекторные функции, провели замену последовательностей ДНК„кодирующих Гч-обласги 1 - и Н-цепей иммуноглобулина человека, на аналогичные фрагменты специфического моноклонального антитела мыши (рис. 10.9). Такую замену можно осуществить разными путями: реплицировать ДНК 1п т)гго с применением олипуцуклеотидов в качесгве затравки либо использовать субклонированные фрагменты ДНК. Сегменты ДНК, кодирующие химерные цепи, встраивали в экспрессирующий вектор и вводили в кулыуру В-лимфоцитов, из которой выделяли наработанные антитела.
Химерные антитела, несущие антигенсвязывающий участок моноктонального антитела мыши к поверхностному антигену клеток рака толстой кишки человека, тестировали на больных с раком толстой и прямой кишки. Антитела оставались в кровотоке примерно в шесть раз дольше обычных антител мыши, тем самым оказывая свое действие в течение большего времени. При этом лишь у одного пациента из !0 наблюдался слабо выраженный иммунный ответ. К сожалению, в этих испьпаниях не удалось получить противоопухолевого эффекта антител; возможно, это было связано с введением их в слишком малых дозах или с тем, что раковый процесс находился на поздних стадиях.
В опытах )п У11го химерные антитела проявляли высокуго зффекторную активность, что позволяет надеяться на успешное их применение в других случаях. Конструирование химерных молекул, о которых шла речь выше, — это первый этап в создании моноклональных антител мышей и крыс, обладающих сходством с антителами человека. Другой подход состоит в замещении только СГ)к-участков человеческих антител фрагмента- Рис. 10.9.
Полученное методом генной инженерии антитело, сходное ио сноси структуре с антитслом человека. Участки ~снов 1.— и Н-цепей иммуноглобулина человека, кодируюшис У,— н Ъ'н-домены, заменены нослсдоватсльностями ДНК, кодируюшими У - и Ун-домсны иммуноглобулина мыши. Продуктом рскомбинантных генов является химерный иммупоглобулин, облалающий антигснсвязываюн1сй специфичностью моноклонаяьного антитгла мьпни, зффскторными свойствами рс-фрагмента иммуноглобулина человека и пониженной иммуногснностью ддя человека.
Микроб>иологическое щюизнодство лекарственных среде щ 217 ми моноклональных антител грызунов (рис. 10.10). Такие «восстановившие форму» антитела человека могут стать эффективным терапевтическим средством, поскольку они по своей антигенсвязывающей способности приближены к исходным моноклональным антителам грызунов. Моноклональные антитела грызунов, сходные с антителами человека, можно получить, выделив кДНК 1.— и Н-цепей из клеточной линии гибридомы грызунов и амплифицировав их вариабельные области с помощью ПЦР.
В качестве праймеров для амплификации можно использовать олигонуклеотиды, комплельентарн ые высококонсервативным сегментам ДНК, фланкирующим с 5'- и 5 чконцов последовательность, копирующую варивбельную область. Зная нуклеотидные последовательности кДНК вариабельных областей легкой и тяжелой цепей ( ььь и *ьььь), легко определить границы СОК, основываясь на том, что соответствующие им последовательности гипервариабельны, в то время как каркасные облвсти относительно консервативны.
Исходя из данных о нуклеотидных последовательностях ДНК, кодирующих С(Ж грызунов, синтезировали шесть пар олигонуклеотидных цраймеров. Каждая пара инициироввла синтез ДНК, кодирующей одну из шести С1Ж грызунов: три, локализованных нв 1-цепи, и три — на Н-цепи. Кроме того, на 5 -конце каждою праймерв находилось 12 дополнительных нуклеоти- Рис. 10.!О. Полученное методом генной инженерии антитело, сходное по своей структуре с аптителом человека. Сегменты ДИК, кодирующис СВК- участки (СВК1, СВК2 и СГЗКЗ) антитела человека, заменены пв последовательности, кодируюшие С17К-участки Р!- и 1.-цепей иммунопьобулипа ммшьь.
Продуктом этого рекомбинантного геьи является иммуноглобулин с антигенсвязыььзющей спеь!иь1)ичностью мопоклонального антитела мыши (участки, выделенные розовым цветом) и остальными свойствами антитела человека (участки, выделенпыс голубым цветом). дов, комплементарных фланкируюьцим последовятельностям каркасных участков ДР! К человека, по которым происходило встраивание С()К-ДНК грызунов (рис. 1О.11). Далее с помощью олигонуьшеотид-направленного мутвгенеза осуществляли последовательнузо замену С1ЖДНК человека альььлиь)ьицированной С(Ж-ДНК грызунов — фактическую «пересадку» СОК от грызунов в каркасные участки молекулы антитела человека. Модифицированную заким образом кДНК антител всграивали в векторы экспрессии и трансформировали ими подходящие клетки-хозяева, обычно Е со)ь' или клетки млекопитаьощих, в которых и вырабатывались антителв.
Данный метод предполагаег, что за антигенсвязывающую способность антитела отвечают только СОК-уььвстки, а не каркасные области. Однако, если связььвание кгибрпдногоь антитела с антигеном происходит недосщточно эффективно, может возникнуп. необходимость в замене некоторых аминокислот в каркасных областях с гьомоьцью олигонуклеотид-направленною мутите неза. К настоящему времени этим меюдом получено более 50 различных моноклональных антител, облвдаюпьих сходством с антителами человека.
К сожалению, данная технология, являясь весьма эффективной и универсальной, довольно дорогостоящая и зребует бол ьш их затрат вре- 218 ГЛАВА 10 Сигнальный пептяд ГК! С!ЭК! ГК2 СГГК2 ГКЗ СПКЗ ГК4 г I Г Г l à — СГЗН! Рис. 10.11. ПИР-амплификаггг!я С(ЗК!-участка, вхоляигего в состав кДНК ! -цепи моноклонального антитела грызуна. Охи гону клеотидныс яра ймеры Р1 и Р2 ком племсптарны последовательностям ДНК С1ЭК! -участка антитела грызуна. Кроме того, каждый праймер содержит на 5'-конце !2 нуклсотидов, ком!шсмеитарпых каркасным >"гасткаы (йаглсг«огМ геа!оп, ГК) кДН К ! -цепи антитела человека. Используя шесть пар олигонуклеотидных праймсров — три лля "гг, - и три лля Ъ', -областей, — с помощью ПЦ!' амплифицировали отдельно каждый из ДИК-ссгмснтов, колирующнх СОК-участки антитела грызуна.
Затем„используя олигонуклеотил-направлсннь!й мугагенсз, заменили ими соответствующие сегменты генон антитела человека. Такая замена оказалась возможной благодаря гому, что амплифицировапные фрагменты содержали участки, комплементарные каркасным областям гена антитела чсловека. мени. Возможно, более прелпочтительным способом получения антител человека н их фрагментов окажется метод, основанный на использовании фаговых «комбинаторных» библиотек, созданных на основе мРНК, полученной из В- клеток неиммунизированных доноров. Производство антител с помощью Е.
со11 Синтез Н- и 1-цепей происходит во время литического цикла бактериофага 2», поэтому можно провести скрининг библиотеки клонов комбинаторных бактериофагов с целью определения их антигенсвязываюшей активности. Гибридомы, подобно большинству других клеточных культур животных, растут относительно медленно, не достигают высокой плотности и требуют сложных и дорогих сред. Получаемые таким образом моноклональные антитела очень дороги, что не позволяет широко использовать их в клинике. Чтобы решить эту проблему, были предприняты попытки созпания своего рода «биореакторов» на основе генетически модифицированных бактерий, растений и животных. Для эффективной доставки и функционирования некоторых иммунотерапевтических среЛств зачастую достаточно одной антигенсвязываюшей области антитела (Га!з- или Гч-фрагмента), т.
е. присутствие Гс-фрагмента антитела необязательно. На рис. 10.12 представлена методика получения функциональных антител с помощью б. со!г' (рис. 10.12). 1. Используя мРН К, выделенную из вырабатывающих антитела клеток (В-лимфоцитов) мыши или человека, синтезируют кДНК. 2. Проводят раздельную ПЦР-амплифицикацию кДНК, кодируюших Н- и 1-цепи. 3. Амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицируюшими энлонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага Х. кДНК Н- и 1-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотндной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и 1.-испей (рис. 10.13, А и Б). 4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
