Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 33
Текст из файла (страница 33)
1аа ЧАСТЬ П. РОСТ Таблица 6.1, РН-индикаторы и диапазоны рН, в которых они используютси Цвет Дмапааон рн Индикатор о н)елочная среда кислая среда 8,0 — 9,6 6,8 — 8,4 6,0 — 7,6 Желтый Тимоловый голубой Феноловый красный Бромтимоловый синий Бромкрвзоловый фиолетовый Метиловый красный Бромкрезоловый зеленый Бромфнноловый синий 5,2 — 6,8 4,4 — 6,0 3,8 — 5,4 3,0 — 4,6 о иснольатют О,Оеув-ный оаствор, для этого О.! г внднкатора растворяют в мвннмвльном ИΠ— ЗО мл) объеме 0.0! в наон в добавляю~ воды до 200 мл 166 димо точное измерение рН, следует придерживаться сле. дующих правил.
1. Доводить температуру буфера, используемого для калибровки рН-метра, до температуры измеряемой пробы, поскольку рН буфера зависит от температуры. Так, рН стандартного фосфатного буфера равен б,98 при 0'С, 6,88 при 20'С и 6,84 при 37оС. Значения рН стандартных буферов при различных температурах приведены в «Справочнике по химии и физике» '1161. 2. Если проба во время измерения перемешивается на магнитной мешалке, то таким же путем нужно перемешивать стандартный буфер. 3. Определять рН сред после стерилизации.
Автоклавирование сред часто приводит к заметным сдвигам рН. Значительный сдвиг рН может происходить даже после стерилизации фильтрованием. 4. Проверять рН среды перед использованием. 5. Поскольку некоторые рН-электроды дают неточные результаты при работе с трио-буфером, необходимо прежде всего убедиться в том, что электроды пригодны для работы с этим буфером. В тех случаях, когда нет необходимости в высокой точности измерений, например при работе с обычными средами, рН определяют с помощью раствора индикаторного красителя или индикаторной бумаги.
При пра- В. ВИОФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ вильном их подборе рН можно измерить с точностью до 0,2 единицы. Индикаторные растворы и бумаги, а также их соответствуюгцие стандартные образцы определенного цвета для различных интервалов рН поставляются большинством фирм, производящих реактивы и научное оборудование. В табл. 6.1 приведены наиболее часто употребляемые рН-индикаторы и диапазоны рН, в которых они используются. Некоторые рН-индикаторы часто добавляют к среде культивирования с целью выявить изменение рН в процессе роста бактерий.
Для этого нужно подобрать соответствующий задаче рН-индикатор и убедиться, что он не подавляет рост микроорганизма. Все рН-индикаторы плохо растворимы в воде и используются в средах в очень низких концентрациях (менее 0,01а/Р). 6.1.2. Буферы Многие бактерии используют или приводят к накоплению в растворах значительных количеств кислых или щелочных ионов. Хотя образование кислоты и ее потребление сбалансированы, в процессе роста могут происходить значительные изменения рН среды.
Грубо рН культуры поддерживают с помощью добавляемых к среде буферов, т. е. веществ, препятствующих сдвигам значений рН. Тонкий контроль за щелочно-кислотными условиями достигается прн автоматической подаче в среду культивирования кислоты или щелочи. Буферы обычно представляют собой смеси слабых кислот и оснований. В комплексных средах буферным действием обладают кислые и основные группы таких органических молекул, как белки, пептиды н аминокислоты. Из-за присутствия различных веществ среды могут обладать буферным действием в широком интервале рН. Однако буферная емкость прн любом заданном значении рН широко варьирует в зависимости от типа присутствующих в растворе органических молекул и их концентрации. Для культивирования многих бактерий необходимо применять забуференные среды.
При выборе соответствующего буфера исходят из: 1) подходящего значения рН буфера, 2) возможного ингибирующего или токси- !67 ЧАСТЫ!. РОСТ Пригодные значения ркд нри та'с Соединение 3,13 4,76 6,39 2,89 5,51 4,01 4,19 4,16 5,61 4,75 7,2! 8,08 9,24 9,87 Лимонная кислота Фталевая кислота Барбитуровая кислота Шавелевая кислота Янтарная кислота Уксусная кислота Одноосновный фосфат Трнс Борная кислота Глинки ческого действия буфера, 3) возможной утилизации компонентов буфера бактериальной культурой, 4) возможного связывания буфером двух- и трехвалентных металлов.
Буферы со слабыми кислотными и основными свойствами наиболее эффективны вблизи значений рН, при которых оии диссоциируют на 50о1о. Эта величина рН соответствует рК, (отрицательный логарифм константы диссоциации) кислоты или основания. Эффективный диапазон буфера отличается от величины рК, не более чем на одну единицу рН. В табл. 6.2 приведен ряд соединений, которые используются в качестве буферов в ростовой среде, а также их наиболее пригодные значения рК, при 25'С. Обратите внимание, что соли лимонной, фталевой и янтарной кислот обладают буферной емкостью в широком интервале значений рН, поскольку соответствующие им кислоты содержат более одного диссоциируемого иона водорода.
Буферы, содержащие перечисленные в таблице вещества, обычно готовят согласно одной из следующих методик. 1. Сначала готовят раствор кислоты или основания в концентрации, вдвое превышающей необходимую, титруют его 5!аОН или НС! на рН-метре до необходимого значения рН и затем доводят раствор до конечного объема, Например, для приготовления 1 л 0,1 М трисНС1-буфера с рН 7,6 титруют 500 мл 0,2 М раствора триса с помощью НС! до рН 7,6 и затем доводят раствор до 1 л.
Разведение почти не влияет на конечную Таблица 6.2. Значения рк, соединений, нснольауемык в буферак б. БИОФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ величину рН. Если же это влияние, хотя и очень незначительное, все-таки существует, проводят окончательную коррекцию рН перед добавлением последних нескольких миллилитров воды во время разведения раствора. 2. Готовят эквимолярные концентрации кислых и основных компонентов системы и смешивают два раствора в соответствующих пропорциях, так чтобы установился необходимый рН. Один раствор тнтруют другим на рН-метре, используя магнитную мешалку. Если требуемое значение рН близко к рК, то соотношение между кислым и основным растворами равно примерно 1: 1.
Если рН на одну единицу выше рК, то это отношение составляет 1:10; при величине рН ниже рК на одну единицу оно равно 10:1. Например, для приготовления !00 мл 0,1 М натрнйфосфатного буфера, рН 7,0, смешивают примерно в равных пропорциях растворы 0,1 М 4чаНаРО4 (одноосновного) и 0,1 М !ча,НР04 (двухосновного), а затем добавляют избыток одного из этих растворов и, контролируя процесс с помощью рН-метра, доводят рН до 7,0. Для приготовления приблизительно 100 мл фосфатного буфера, рН 6,0, титруют 95 мл одноосновного раствора двухосновным. Для бактериальпых ростовых сред наиболее широко используются фосфатный, трис-солянокислый, цитратный и ацетатный буферы. Эти четыре буферные системы охватывают практически весь интервал значений рН, в котором могут расти бактерии.
В табл. 6,3 приведены смеси, используемые для приготовления буферов, а также соотношения компонентов для получения данного рН смеси. Как упоминалось выше, рН любого буфера зависит от температуры. Таблицы для приготовления других смесей, обладающих буферным действием при различных температурах, приведены во многих руководствах !"2, 3, 9, 16). При инкубации культур в атмосфере, обогащенной СОИ как правило, используют буфер, содержащий угольную кислоту и бикарбонат. Концентрация в среде угольной кислоты (Н,СОА) прямо зависит от парциального давления СО, в атмосфере.
Согласно уравнению Гендерсона — Хассельбаха для этой системы НСО Р~ РК +1К СО !69 ЧАСТЬ Н. РОСТ Таблица 6.3. Првготовлеиие буферов, часто используемых в бактериологических средах' рн 41,0 36,8 30,5 25 5 20,0 14,8 10,5 8,8 4,8 46,0 43,85 40,75 36,75 31,25 25,5 19,5 14,0 9,5 6,5 4,25 2,65 44,2 41,4 38,4 32,5 26,8 21,9 !6,5 )2,2 8,1 5,! Далные нв рабаты 13) х мл 0,2 М уисусной кислоты+(00 — х) мл 0,2 М ацетата натрии, довести водой да 100 мл.
а Х МЛ 0,1 М ЛИМОИНОй КИСЛОтЫ+(00 — Х) МЛ 0,2 М НагНРОо ДОВЕСТИ ВО. дой до !00 мл г х мл 0,2 М ХаНгРОг+(50 — «) мл 0,2 М ХагНРОг, Довестн воДой До 100 мл. 00 мл 0,2 М гриса Ьх мл 0,2 М НСЬ повести водой до 100 мл. величина рК' при 20'С составляет около 6,4. Отсюда молярное соотношение между СО2 и бикарбонатом !НСОз-) равно 1:! при этом значении рН, а СО2-бнкарбонатный буфер эффективен в диапазоне рН 5,4 — 8,0.
Если рН среды ниже 5,0, то в ней практически отсутст. !70 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4 7.6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6 8,8 9,0 Величина х, иснальауемаа в оровисах буферов 30,7 29,4 27,8 26,7 25,2 24,3 23,3 22,2 21,0 19,7 17,9 16,9 )5,4 !3,6 9,1 6,5 З. БИОФИЗИ»1ЕСКИЕ ФАКТОРЫ Тлблппл 6.4. Растворимость СОв и воде и велпчпиы рК' угольной кислоты прп разных температурах' Температура, 'С Растворимость СО» Температура, 'С Растворимость СО РК' рк О, 592 0,530 6,328 6,312 20 25 30 0,876 0,759 0,665 6, 392 6,365 6,348 35 40 Данные Умбректа и др. [ЗЗ[. Мнллилнтры СО» на ! мл воды ири давлении ! атм. !7! вует бикарбонат, и увеличение концентрации СОз в атмосфере будет приводить к снижению рН за счет образования угольной кислоты.
При концентрации СОз в атмосфере от 60 до 100о[о среда должна быть очень щелочной для поддержания уровня рН, близкого к нейтральному. Однако следует помнить, что присутствие в среде солей в высоких концентрациях может оказаться токсичным для бактерий.
После соответствующего преобразования уравнение Гендерсона — Хассельбаха можно использовать для определения количества бикарбоната, добавляемого в среду в качестве буфера при данном значении рН и различном содержании СОз в атмосфере. Для расчетов используют уравнение !й (НСОв ) = рН вЂ” рК'+18 Р (гв) (о4СО ) (587 [от) где Р— атмосферное давление в мм рт. ст., а — растворимость СОз (в мл) в 1 мл воды, а о[оСОз — процентное содержание СОз в атмосфере.
Если атмосферное давление равно 720 — 760 мм рт. ст. (примерно 96,0— !О!,3 кПа), то его колебания оказывают незначительное влияние. Поэтому в большинстве случаев можно использовать следующее упрощенное уравнение: 18 (НСОа-) = РН вЂ” РК'+ 18 сс ($',СО,) (4,35 !О-е). Величины а и рК' для различных температур приведены в табл. 6.4. Подробности использования карбонатных буферов можно найти в работе Умбрейта и др.
1361. Обычные буферы не могут стабилизировать значения рН сред, используемых для выращивания бактерий, об- чзсть 1ь Рост разующих большое количество кислоты (например, молочнокислых). В этом случае кислоту следует максимально быстро нейтрализовывать, добавляя к среде тщательно измельченный мел (СаСОз). При добавлении порошкообразного мела (0,3%) к агару в чашках удобно наблюдать за образованием кислоты растущими колониями. Однако в этом случае необходимо убедиться, что мел был хорошо суспендирован в агаре при его разливе по чашкам.
Колонии, образующие кислоту, формируют вокруг себя зоны просветления. Кислоту можно также удалить в системе культивирования с диализом (разд. 10.3.4). 6.1.3. Постоянный контроль В тех случаях, когда рН культуры необходимо поддерживать в узком интервале, используют систему автоматического поддержания значений рН. Такая система должна включать рН-метр, стерилизуемые паром рН- электроды, устройство для поддержания заданного рН и насосы для добавления кислоты или щелочи.
Большинство систем обычно оснащено самописцем, обеспечивающим постоянную регистрацию рН. Автоматические системы выпускает ряд фирм: Хек Вгнпзчг!ск Яс!еп1!1!с Со., Меч ВгнпзчпсК М. 3.; Тпе ч!г Т!з Со., 1пс., Оагг!!пег, Х. У.; Со!е-Ра!гпег 1пз(гнтеп! Со., СЫсадо, 1!1.). Имеются в продаже также стерилизуемые паром рН-электроды в различных наборах (Вескгпап 1пз(гшпеп(з, 1пс., Рн!1ег1оп, Са!!1.; 1пдо!б Е!ес1годез, Еех(яд!оп, Маза.; Ееебз апд Ыогйгнр, Ног()з Юа1ез, Ра.). Точность системы рН-контроля следует достаточно регулярно проверять с помощью отдельного рН-метра. При этом могут возникнуть следующие проблемы: 1) неправильное или недостаточное заземление системы; 2) старение стеклянных рН-электродов при их стерилизации паром; 3) загрязнение мембраны электрода сравнения компонентами среды и продуктами бактериального метаболизма в процессе длительной работы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
