Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 31
Текст из файла (страница 31)
сой достаточно добавить в качестве носителя 20 — 40 мкг немеченого лейцина, чтобы достичь равномерного включения метки. Когда ввести метку по каким-либо соображениям невозможно, содержание белка измеряют и в присутствии тритона Х-100 модифицированным методом Лоури, описанным в работе 1111, в соответствии с которым к пробе добавляют избыток ДСН. Последний образует стабильные смешан. ные мицеллы с тритоном, не мешающие измерениям.
Тритон Х-100 и другие сходные с ним неионные детергенты растворяются в водно-спиртовых смесях, а белки из таких смесей можно выделить осаждением в этаноле. Пробу помещают на лед и к ней добавляют при перемешивании 2 объема охлажденного на льду абсолютного этанола.
Смесь выдерживают в течение ночи в морозильнике и собирают осадок белка центрифугированием. Для эффективного осаждения требуется концентрация белка не меньше 0,2 Игал, Разбавленные растворы белка концентрируют в аппарате длн ультра- фильтрации фирмы Лппсоп с помощью фильтра РМ-ЗО. Правда, следует иметь в виду, что при этом концентрируются также и мицеллы детергента. ДСН удаляют из проб ацетоновым осаждением. Шесть объемов безводного ацетона добавляют к пробе при комнатной температуре, а выпавший осадок отделяют центрифугированием.
Осадок промывают несколько раз водно-ацетоновой смесью (6 1). Так как осадок часто оказывается воскообразным и с ним трудно работать, мы обычно диспергируем его в воде гомогенизатором Поттера, а затем лиофилизуем. 155 ЧАСТЬ Ь МОРФОЛОГИЯ 5.2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле Электрофорез в полиакрнламидном геле в присутствии ДСН представляет собой самый простой н самый эффективный способ выявления набора полнпептидов, присутствующих в субклеточных фракциях. Этот метод сейчас во многих случаях заменяет ферментативный и химический анализ при установлении чистоты и гомогенности субклеточных фракций. Для электрофореза в полиакриламидном геле используются разнообразные выпускаемые промышленностью н самодельные приборы. Мы предпочитаем те приборы, которые позволяют проводитьразделенне в тонких пластинах геля, что обеспечивает оптимальное разрешение.
Лучи|ее разрешение на пластинах обусловлено тем, что возникающее во время электрофореза тепло здесь легко рассеивается, а также тем, что гель после электрофореза можно быстро фиксировать. Последнее важно для того, чтобы свести к минимуму диффузию белка в полосах. Пластины позволяют одновременно сравнивать много проб, и их легко сохранять после высушивания на листах фнльтровальной бумаги. Радиоактивность в пробах выявляют радиоавтографней и фотофлюорографией, а высушенные на фильтровальной бумагегели можнолегко нарезатьножницамн илн резаком и после повторного насьпцения водой вырезанных сухих полосок просчитывать на сцинтилляционном счетчике.
Если не требуется большая разганка в геле, электрофорез, фиксацию, окраску и высушивание успевают проводить за один день. Для гель-электрофореза в присутствии ДСН имеется большой набор буферных систем. Лучшее разрешение дают концентрированные буферные системы, у которых верхний (электродный) буфер содержит ионы, обладающие большой подвижностью н движущиеся через гель в виде передней зоны, или фронта.
К моменту вхождения в разделяющий гель белки сжимаются этим движущимся фронтом в узкую полосу, а войдя в него, задерживаются за счет того, что гель обладает свойствами «ситаз. Описанная ниже система представляет собой модификацию концентрирующей буферной системы, предложенной Лэмли 15]. См. также равд. 25.5.1. 156 К ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИИ Разделяющий, или разгоняющий, гель содержит 11,5% акриламида, 0,2% бисакриламида и 0,1% ДСН в 0,375 М трис-буфере, доведенном НС1 до рН 8.8. Полимеризацня инициируется удалением воздуха из раствора и добавлением тетрамстилэтилендиамина (до 0,8% ) и персульфата аммония (до 0,015%). Пока не произойдет полнмеризация, разделяющий гель держат под слоем воды. Воду выливают и наслаивают концентрирующий гель, или гель для нанесения, содержащий 4,5% акриламида, 0,12% бисакриламида н 0,1%> ДСН в 0,125 М трис-буфере, доведенном НС1 до рН 6,8.
Этот гель полимернзуется добавлением тетраметилэтилендпамина (до 0,125%) и персульфата аммония 1до 0,05%). Перед полнмеризацией, чтобы сформировать лунки для проб, в концентрирующий гель вставляют тефлоновую 1фторопластовую) гребенку. После полимеризацни образовавшиеся лунки промывают несколько раз электродным буфером, содержащим небольшое количество бромфенолового синего. При этом удаляется непрореагировавший персульфат, а границы лунок слегка окрашиваются, так что их можно видеть при нанесении проб. Верхний электродный буфер содержит 0,182 М глицнн, 0,0255 М трнс (конечное значение рН 8,3) и 0,1з/о ДСН. Нижний электродный буфер содержит те же компоненты, за исключением ДСН.
Пробы растворяют в буфере для концентрирующего геля, к которому добавлены 12,5 /о глицерина, 1,25% ДСН и 1,25% 2-меркаптоэтанола. До электрофореза их прогревают в течение 5 мин в кипящей водяной бане для того, чтобы прошла полная диссоциация и денатурацня всех белков. В качестве красящей метки к пробам можно добавить бромфеноловый синий или феноловый красный. Окончательно приготовленные пробы должны содержать 1 — 5 мг/мл белка, причем в маленькие лунки (ЗХ0,75 мм) достаточно вносить 5 — 25 мкг белка.
Так как проводимость геля меняется по мере прохождения через него концентрирующего буфера, следует поддерживать постоянными напряжение или мощность, а не ток. Пока исследуемая смесь не вошла в разделяющий гель, устанавливается начальное напряжение, равное 50 В; затем напряжение повышают до 145 В на весь !57 чАсты. ИОРФология остаток пути. Для наилучшего разрешения температура геля должна быть 25'С. Самый распространенный недостаток электрофореза в полиакриламнде состоит в искривлении полос вследствие неправильно проведенной полимеризацин. Чтобы этого не было, гелевые растворы нужно тщательно дегазировать перед заливкой, а верхнюю кромку разделяющего геля после полимеризации несколько раз промывать, чтобы удалить все остатки незаполимеризовавшегося геля.
Реактивы для электрофореза бывают разными по чистоте, и для того, чтобы время полимернзации было всегда постоянным, необходимо увеличивать или уменьшать количество персульфата аммония. Для разделяющего геля оптимальное время полимеризации составляет 30 мнн. При большей длительности гель становится мягким или не полностью полимеризуется, а при меньшей — полимеризацня может пройти неравномерно, что приведет к появлению волнистых белковых полос. Персульфат аммония очень гигроскопичен и не отличается стабильностью.
Рекомендуется готовить исходный концентрированный раствор персульфата аммония (50 мг/мл), который хранят в замороженном состоянии порциями по 1 мл. Такой раствор стабилен в морозильной камере в течение нескольких месяцев. Полосы могут быть также размазанными из-за присутствующих в пробе липидов и гликолипидов !распространенный случай — присутствие липополисахаридов). Липиды связывают значительную часть ДСН, и фактически их присутствие может привести к истощению ДСН, доступного для связывания с белками, мигрирующими в геле.
Эту трудность преодолевают, увеличивая количество ДСН в верхнем электродном буфере до ! % и выше. Гели окрашивают по методу Фейербенкса и др. 12). При слабом покачивании гели вымачивают по ! ч в каждом из следующих растворов: 1) 525 мл 95%-ного изопропанола, 200 мл ледяной уксусной кислоты, 1,0 г кумасси ярко-синего и 1275 мл воды; 2) 210 мл 95%-ного изопропанола, 200 мл ледяной уксусной кислоты, 0,1 г кумасси ярко-синего и 1590 мл воды; 3) 200 мл ледяной уксусной кислоты, 0,05 г кумасси ярко-синего и 1800 мл воды и 4) 10%-пая чксусная кислота.
После К ПОЛУЧЕННЕ КЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЙ полного обесцвечивания геля его вымачивают перед высушиванием в 1ОЪ-ной уксусной кислоте, содержащей 1з(> глицерина. 5.3. ПРИМЕР ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ: Е. сой 5.3.1. Полное фракционирование Схему, показанную на рис. 5.1, можно использовать для Определения внутриклеточной локализации какого- либо фермента илн белка, принадлежащего Е.
сой или другим кишечным бактериям. Преимущество этой схемы заключается в том, что при низких концентрациях Мй'~ (в данном случае источником Мд'+ служат как сами клетки, так и буфер для разрушения) наружная мембрана нерастворима в тритоне Х-!00, в то время как цитоплазматическая мембрана полностью растворима. При разрушении клеток силами сдвига некоторые цитоплазматические мембраны сильно дробятся (вероятно, до небольших, «открытых» мембранных фрагментов) и нх нельзя уже осаждать ультрацентрифугированием. Поэтому первую надосадочную цитоплазматнческую фракцию (надосадочная жидкость 1 на рис. 5.1) инкубируют при 21'С.
При температуре выше температуры фазового перехода мембранных липидов крошечные фрагменты агрегируют, т. е. сливаются в мембранные фрагменты больших размеров, которые можно затем осадить 16]. В некоторых случаях неосаждаемая фракция мембран может составлять до 20 — 30010 цитоплазматических мембран. Она образуется при разрушении клеток не только с помощью пресса Френча, но и прн обработке их ультразвуком или даже при быстром лизисе протопластов или сферопластов. При такой схеме фракционнрования невозможно выяснить, откуда происходят растворимые белки в из цитоплазмы или из периплазмы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
