Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Эти термостаты позволяют контролировать рост бактерий в более широких температурных интервалах и содержат устройства для аэрации культур микроорганизмов с различными ЧАСТЬ 11. РОСТ потребностями в кислороде. Такие термостаты с температурными градиентами нужны при измерении некоторых параметров роста. Пока этих термостатов нет в продаже, но их можно легко изготовить в мастерских. 6.4. ДАВЛЕНИЕ Высокое гидростатическое давление оказывает неблагоприятное влияние на рост и выживание бактерий. Хотя в интервале давлений 1 — 100 атм большинство видов бактерий малочувствительно к нему, при этом давлении не удается выделить чистую культуру облигатно-барофильных бактерий 18~. Исследования культур в условиях высоких давлений весьма ограничены, и мы не будем здесь останавливаться на соответствующих методах.
Маркиз '181 предложил некоторые методические приемы выращивания культуры при высоком давлении. Тэйлор и Янах 133~ разрешили одну из основных проблем в данной области: они сконструировалн аппарат, который позволяет в условиях высокого давления вносить в культуру добавки и отбирать пробы, не вызывая при этом перепадов давления. 6.5. КИСЛОРОД Аэробные и факультативно-анаэробные бактерии утилизируют растворенный кислород, и поэтому их рост и метаболизм зависят от концентрации кислорода в растворе.
Растворенный кислород является таким же питательным компонентом, как глюкоза или аммоний, однако в отличие от большинства подобных компонентов он довольно плохо растворим ~(10 мг/л). Поэтому для бактерий, выращиваемых в жидких средах, кислород может быстро стать лимитирующим фактором, если не принимаются специальные меры, обеспечивающие его постоянную подачу и растворение в среде во время роста бактерий. Отметим следующие основные факторы, на которые следует обратить внимание при аэрации жидкой культуры.
1, Доступность кислорода на границе раздела фаз питательная среда — газ. Сосуд с культурой следует за- 178 а БиОФизнческив Флктогы крывать пробкой или крышкой из пористого материала, так чтобы обеспечивался максимальный газообмен. 2. Поддержание большого отношения площади контакта газа с жидкой средой к объему последней.
Со стационарными культурами это удается при использовании очень плоских сосудов. Благодаря встряхиванию колб на качалках площадь поверхности среды значительно увеличивается, причем этот эффект еще больше усиливается при создании турбулентных потоков среды за счет углублений в боковой части колб или при помещении в них изогнутой стальной пружины. С увеличением объема перемешиваемой культуры происходит быстрое падение ее насыщения кислородом, При работе с большими объемами среды (0,5 — 1 л) обычно продувают через жидкость воздух. В таких культурах эффективность растворения кислорода зависит от числа и минимального размера воздушных пузырьков, а также от длительности контакта между пузырьками и жидкостью. При использовании газовых барботеров с малыми размерами пор получают мелкие пузырьки, однако при этом возникают условия, способствующие образованию пены.
Длительность контакта между пузырьками и жидкостью можно увеличить, используя сосуды с большим отношением высоты к диаметру; этот же эффект достигается путем перемешивания культуры или с помощью перегородок в сосудах. Системы аэрации при культивировании бактерий подробно обсуждаются в гл. 10, а также в работах Пирта [10] и Уэнга и др [15]. 6.5.1. Растворенный кислород Для измерения растворенного кислорода наиболее подходящим способом является полярография с помощью кислородного электрода, принципы и методические приемы которой описаны ниже (разя. 16,2.3). Подробности методов с использованием полярографа для измерения скоростей растворения кислорода в культурах можно найти у Пирта [10], Уэнга и др.
[15] и Хитчмэна [4]. !?9 часть и Рост 6.5.2. Скорость поглощения кислорода Скорость поглощения кислорода (СПК) выражается в миллимолях на литр в минуту и легко определяется химически по скорости окисления сульфита в сульфат растворенным кислородом в присутствии медного катализатора. Этот метод дает информацию об эффективности системы аэрации, однако истинная СПК в бульонных культурах может значительно отличаться от СПК в водных растворах сульфита натрия.
Существует ряд способов измерения СПК в средах как в присутствии биомассы, так и в ее отсутствие 11, 10, 15!. Ниже приводится простой метод измерения СПК по окислению сульфита 123]. 1. Вместо ростовой среды используют соответствующий объем раствора сульфита натрия, содержащего 0,001 М сульфата меди, с той же степенью аэрации и при той же температуре, которые характерны для изучаемой среды. Концентрация сульфита натрия в каждом случае зависит от условий аэрации (см. ниже).
2. В различные интервалы времени после начала аэрации вносят дважды по 5 мл раствора сульфита в пробирки размером 2,5рс',25 см, содержащие небольшие кусочки сухого льда. Выделяющийся СОз перемешивает образец во время титрования и, покрывая его, препятствует дальнейшему окислению. Если образец замерзает, подогрейте его перед окончанием титрования. 3. Добавляют несколько капель крахмального раствора и титруют раствор сульфита до постоянного голубого окрашивания свежеприготовленным раствором иода, который калиброван по стандартному раствору тиосучьфата натрия. Нормальность раствора иода должна составлять около '!з нормальности раствора сульфита. 4.
СПК рассчитывают следующим образом: Разность ио результатам титрования (мл) Х СПК ХНормальность раствора иода 4 Х !000 мл ! Х 8 мл мин ' Следует отметить, что по этому уравнению можно рассчитать концентрации сульфита и иода, соответству- !80 б. БИОФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ющне данной эффективности аэрации. Например, еслн СПК составляет около 3, то использование 0,15 н. раствора иода прнводит к разности по результатам титрования около 4 мл за 1О мин.
Начальная концентрация сульфнта натрия должна быть в пять раз больше концентрация иода, т. е. 0,75 н. 6,6. АНАЭРОБИОЗ Иногда трудно провести четкую границу между аэробнымн и анаэробными условнямн. Существуют бактерии, растущие как в присутствии кислорода, так н в его отсутствие (факультативные формы) нлн предпочитающне среды с низким напряженнем кислорода (мнкроазрофилы). Бргггч!ипг ио1гг1агги являются облигатными мнкроаэрофнламн, поскольку для инициации роста онн требуют присутствия кислорода в низких концентрациях ( от 3 до 9070 Оз).
Методы культивирования микроаэрофнльных бактерий приведены в разд. 9.3.1. Хотя облнгатными аиазробами обычно считают бактерия, рост которых невозможен в присутствии растворенного кислорода, на практике к анаэробным относят те бактерии, которые не растут на поверхности (илн около нее) твердой нлн полужндкой среды на воздухе при атмосферном давлении, Лэротолераптные анаэробные бактерии хорошо растут на поверхности агара в чашках при низком, но ощутимом уровне кислорода в атмосфере 124), тогда как более строгие анаэробные бактерии почти немедленно гибнут в такой атмосфере. Прн удалении кислорода предварительным кипячением среды или его замещении инертным газом условия, необходимые для роста строгих анаэробов, не достигаются. Окнслнтельно-восстановительный (нлн редокс) потенциал (Е)г) позволяет наиболее удобно измерять степень анаэробноза 161.
Иными словами, Е)г — это мера способности раствора отдавать нлн принимать электроны, т. е. окнсляться илн восстанавливаться. Е(г выражают в единицах разности электрического потенциала, т. е. в вольтах: чем более положительна эта величина, тем выше концентрация окислителя по отношению к восстановнтелю в растворе, н наоборот. Способность !81 ЧАСТЬ !!. РОСТ среды противодействовать изменениям ЕЬ аналогична буферным свойствам растворов. Обычно в средах, используемых в лаборатории, за увеличение ЕЬ в основном ответствен кислород; при высоких положительных значениях Е)!, обусловленных присутствием растворенного кислорода, подавляется рост всех анаэробных бактерий.
В то же время положительные значения Е)!, обусловленные присутствием в среде других веществ, могут не препятствовать росту даже строгих анаэробов [30, 361. Устойчивость к Е)! разных анаэробпых бактерий различна. Однако в стандартной среде рост большинства анаэробных бактерий подавляется при величинах ЕЬ выше — 100 мВ. Некоторые из них не растут при потенциале выше — 330 мВ; теоретическая концентрация кислорода прн этом значении ЕЙ составляет 1,48 10 " молекул на 1 л [61.
Даже при потенциале — 140 мВ концентрация кислорода составляет только 1,5 10" молекул на 1 л [10], т. е. менее 1 молекулы кислорода на клетку для многих бактериальных культур. Это показывает, что для выращивания строгих анаэробов важно создание более восстановительных условий, чем те, которые обеспечиваются простым удалением кислорода из культуральной среды. 6.6.1. Измерение Е1! Е)! раствора наиболее точно можно измерить электрометрически. Подробно способы измерения и необходимые при этом предосторожности описаны в обзоре Джекоба ',[71. Рассмотренные в нем методики приемлемы для бактериологов общего профиля.
Чтобы найти Е)! сред и культур, особенно для анаэробных бактерий, широко используют окислительно-восстановительные красители. Эти красители обратимо окисляются и восстанавливаются, причем в окисленном состоянии они окрашены, а в восстановленном — бесцветны. Разные красители восстанавливаются при различных значениях Е)!.
Величина ЕЬ, прн которой краситель окнслен или восстановлен иа 50а/е при рН 7,0, называется стандартным окислительно-восстаиовнтельным потенциалом (Ео'). !82 б. ЕиОФизические Флкторы Таблица 6Л. Стандартные окислительно-восстановительные ПОтЕНцнаЛЫ КраСИтЕЛЕй Прн рн 7,0 И 30'Са Е'о, ыв Ьое, ын Краситель 1Ыетиленовый синий Толуидиновый синий Индиготетрасульфо. наг Резоруфина Индиготрисульфонат — 125 — 160 11 — 11 Индигодисульфонат Индигомоносульфонат 1,5-антрахинонсуль. фат Феносафранин Бензилвиологен — 200 — 252 — 359 — 46 — 51 — 81 и Данные иэ работы Джекоба 1У1, где можно найти более реналь красителеи. б Продукт перааго этапа аосстаноалеоии ресаэурнна.
полный пе- 183 В табл. 6.5 перечислены некоторые наиболее распространенные красители и нх стандартные окислительновосстановительные потенциалы, Весь диапазон ЕЬ от полного окисления до полного восстановления, который охватывается окислительио-восстановительным красителем, составляет около 120 мВ при постоянном значении рН. К примеру, метнленовый синий (Ео'= 11 мВ при рН 7,0) почти полностью окислен (окрашенный) при Е)1=71 мВ и почти полностью восстановлен (бесцветный) при ЕЬ= — 49 мВ (7), Окислительно-восстановительный потенциал красителей зависит от рН.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
