Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 36
Текст из файла (страница 36)
Например, метиленовый синий при значениях рН 5,0, 7,0 н 9,0 восстановлен иа 50$ при Е)у, равном соответственно 101,11 н — 50 мВ [8). Точная зависимость Е,' от величины рН связана с видом красителя. Для большинства красителей Ео' увеличивается от 30 до 60 мВ при падении рН на единицу, и наоборот. Для определенных бактерий некоторые окислитель- но-восстановительные красители токсичны даже в очень низких концентрациях. За исключением случаев, когда известно, что данный краситель нетоксичен, при использовании красителей ставят соответствующие контроли.
Прн этом краситель вносят в максимально низкой концентрации, так как он может изменить Е)1 той среды, в которой окислнтельно-восстановительный потенциал слабо забуферен 17) ЧАСТЬ 11. РОСТ Многие анаэробные бактерии могут быстро снижать Ей среды; их способность к росту в среде зависит от физиологического состояния и количества инокулята. Задержка роста после ннокуляции наблюдается до тех пор, пока клетки не снизят потенциал до уровня, прн котором они могут расти. За снижением потенциала лучше всего следить, включив в среду нетокснчный индикатор ЕЬ.
Для этой цели широко используется ресазурин в концентрации от 0,1 до 0,2 мг на 100 мл. Индикатор вначале подвергается необратимому восстановлению в резоруфин, который окрашивается в розовый цвет прн нейтральных значениях рН. Е,' резоруфина равен — 51 мВ при рН 7,0; при Е(1 около — 110 мВ резоруфин обесцвечивается 17). Когда необходимы очень строгие анаэробные условия, в среду можно добавить феносафранин (Е,'= =252 мВ) после предварительной проверки его токсичности.
Цитрат титана(111) является как восстановителем (Е,'= — 450 мВ), так и индикатором Е(1 1371. При полном окислении он обесцвечивается. Его использование будет описано ниже вместе с другими восстанавливающими агентами. 6.6,2. Восстанавливающие агенты Восстанавливающие агенты добавляют в большинство сред, предназначенных для культивирования анаэробов, чтобы снизить окислнтельно-восстановнтельный потенциал и сбалансировать его на оптимальном уровне.
Помимо того что этн вещества должны быть нетоксичными в используемых концентрациях, они должны приводить к такому снижению потенциала, которое было бы приемлемым для исследуемых организмов. Восстанавливающие агенты, особенно широко используемые при культивировании анаэробов, перечислены в табл. 6.6. Все приведенные в ней соединения имеют Е,' достаточно низкий, чтобы полностью восстановить ресазурин, однако для выращивания строгих анаэробов следует использовать только те агенты, для которых ЕА'< ( — 300 мВ.
Восстанавливающий агент сохраняет максимальную эффективность, если основной раствор, лишенный кис- б. виофизичаскир ФАктОРы Таблица 6.6. Восстанавливающие агемты, применяемые при иультивированнн аиаэробов Концентрация в среде Еа', мв Соединения 0 05ой 0 025ат( О, 05отй ( — 1ОΠ— 210 (22( — ЗЗО (22) — 420 — 480 — 571 (6) Тиогликолат натрия Цистеии НС1" л)итиотрейтола Н,+Хлористый палладий (18( Титан(П!)-цитрат' (37) ХарЬ 9Нзбм (или НзЬ) Цнстеин НС1+ХааЬ 9НзО' 0,5 — 2 нМ 0,025а4 0 025о(+О 025ай н Основные растворы автпилавнруют и храпят в атмосфере, лишенной кислорода.
б К бо мл 0,2 М цитрвта натрия добавляют б мл 1бтв-ното раствора трнхлорнда титана и нейтрализуют насыщенным раствором бпкарбоиата натрия. После стерилизации филырованием добавляют Зо мл этой смеси к 1 л стерильной среды, «е содержащей кислорода. Комплекс титан(1111-цитрат нрн восстановлении окрашиваетсн в светло-фналетпвый цвет, а прн окислении обесцвечивается. 6.6.3. Методы культивирования нестрогих анаэробов Методы приготовления сред для культивирования и пересева нестрогих аиаэробных бактерий, включая 185 лорода, стерилизуют и хранят в атмосфере инертного газа (методы приготовления восстановленных сред приведены ниже). К среде восстанавливающий агент добавляют в необходимой ко1щептрации непосредственно перед опытом. Для сннжения Е)1 среды при последующем культивировании анаэробных бактерий можно использовать также факультативно-аэробные бактерии.
Так, выращивание в среде клеток Е. соД перед инокуляцией апаэроба приводит к удалению всего остаточного кислорода и снижению Е)г до уровня, который наблюдается в условиях полной защиты культуры от кислорода. Перед инокуляцией анаэроба клетки Е. Ео(( можно убить нагреванием. Это необходимо для того, чтобы была уверенность, что используемые факультативные микроорганизмы не влияют иа рост анаэробов ни в результате конкуренции за питательные вещества, ни путем выделения токсичных продуктов. чАсть и, Рост большинство клостриднев, довольно просты [13). Все операции можно проводить в обычной атмосфере при условии соблюдения некоторых предосторожностей для того, чтобы избежать длительного контакта бактерий и среды с кислородом.
Для выращивания нестрогих аназробов существуют следующие приемы. 1. Среду готовят в сосудах, где отношение поверхности среды к ее объему достаточно мало. 2. Для длительной ипкубации анаэробов, не образующих газы, например фотосинтезирующих бактерий, наиболее подходящими являются бутыли и сосуды, доверху заполненные свежепрокипяченной средой и закрытые завинчивающимнся крышками. 3.
Готовят полужидкую среду, добавляя к жидкой среде 0,05 — 0,10~Р агара. Полужидкая среда способствует уменьшению конвекционных потоков. 4. На поверхность инокулнрованной среды наслаивают толстый слой васпара (50% вазелина — 50'4 парафина). 5. Среду автоклавируют сразу же после смешивании компонентов с восстанавливающим агентом. 6. Среды долго не хранят. Их нельзя хранить в холодильнике, поскольку по мере понижения температуры растворимость кислорода растет.
7. Для контроля за степенью окислепности среды к ней добавляют ресазурин (0,1 мг на 100 мл). Если верхняя треть среды окрашивается непосредственно перед употреблением, ее кипятят и охлаждают перед инокуляцией. 8. Используют по возможности большие объемы инокулята. 9. Культуры разводят в пробирках с ростовой средой или в свежеавтоклавированном растворе, содержащем восстанавливающий агент.
10. Некоторые азротолерантиые анаэробы (например, С1оз1ТЫшт рег1ппдеьа) можно развести в чашке Петри, нанести на поверхность свежей агаровой среды, содержащей восстанавливающий агент, и поместить чашку в камеру, лишенную кислорода. Однако клетки ряда других аназробов чувствительны даже к кратковременному контакту с воздухом. К БИОФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ 11. Чашки Петри со свежеприготовленными средами, инокулированными аэротолерантными анаэробами или спорамн анаэробов, инкубируют в анаэробных условиях. Для этого можно использовать одну из следующих систем. Вакуумный эксикатор.
Его используют только для аэротолерантиых анаэробов. Трижды откачивают воздух, пока давление не упадет до 500 мм рт, ст., и заполняют эксикатор инертным газом, например азотом, водородом нли их смесью с примесью 5 — 1Оэ1э СОз (некоторые анаэробы нуждаются в СОз). Сосуды для анаэробов (анаэростаты) с катализатором. Наиболее часто используют сосуд системы ТогЬа!, модель А-3 (ТЬе Тога!оп Ва1апсе Со, С)ау!оп, Ы. Л.).
Из него откачивают воздух, как описано выше, и трижды заполняют водородом или газовой смесью с большим содержанием водорода, Чтобы проверить, активен ли катализатор, его подставляют под струю Нсл активный катализатор сильно разогревается уже через 1 мин. Реактивируют катализатор нагреванием до 160'С в течение 1 ч. Пакеты или сосуды с генераторами Н,+СОФ Наиболее часто используют систему Паз Рак (ВВ1. М1сгоЬю!оцу Вуз1егпз, Сос!геузч11)е, Мд.), не требующую откачки воздуха. После активации газогенераторного элемента водой пакет быстро закрывают и следят в течение 30 мин за конденсацией воды. В прозрачные пакеты или сосуды можно поместить полоски индикатора (метиленовый синий) и наблюдать за их обесцвечиванием.
Катализатор проверяют и реактивнруют, как описано выше. 6.6.4, Метод Хангейта культивирования строгих анаэробов Многие анаэробы, находящиеся в кишечнике, рубце или в других прнродяых анаэробных условиях, растут только при очень низком окнслительяо-восстановительном потенциале. Поэтому необходимо защищать среды и клетки даже от кратковременного контакта с кислородом. Как это делают на практике, мы рассмотрим в данном и следующем разделах книги на двух примерах. Для выделения н сохранения чистых культур строгих 187 члсть и. Рост анаэробов Хангейт [25) предложил метод вращающихся пробирок. Вскоре появилось много модификаций его метода.
Основным преимуществом этого метода является то, что для работы требуется минимум специальной аппаратуры, а для культивирования специфических групп, например метанобразующих бактерий [!7[, может быть создана любая атмосфера. Подробное описание различных модификаций метода можно найти в ряде статей [6, 17, 28, 291. В книге «АпаегоЬе !аЬога1огу шанца!» [15), опубликованной Виргинским политехническим институтом совместно с Университетом штата Виргиния, приведены модификации методов ускоренной работы с большим числом анаэробных культур.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
