Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Для этого требуется отдельный эксперимент, в котором клетки подвергают осмотпческому шоку по методике Неу и Хеппла 17] с высвобождением белков периплазмы. Если окончательно получаемую фракцию цитоплазматнческих мембран (надосадочная жидкость П! на рис. 5.1.) собираются анализировать гель-электрофоре- 159 чдсть г мОРФОлОГия РАЗРУШЕННЫЕ КЛЕТКИ рифугиробание ч« прт оод ОСАДОК 1 абьединение с осадком Л НАДОСАДОЧНАЯ ЖИДКОСТЬ 1 и«кубан«я домин при 21«С Центауифугиробание ч ч К П НАДО (ЦИТ спендиробание обьединенкв осад«об до конценлран ~амг/мл белка б том е буфере, «сторонй испольбалсп при разрушении еток бабление к~ритона Х-гаа коне«ной концентрации мг/мл нтрифугиробание гч при ааау ОСАДОК Ш (НАРУЖНЫЕ МЕМБРАНЫ) НАДОСАДОЧНАй ЖИДКОСТЬ Ш (ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ) Рис.
бл. Схема фрзкциоиировзиия клеток Е, со!С используемая для обнаружения локзлиззции какого-либо фермента или белка внутри клетки. Клетки разрушают иа прессе Френча в 11ЕРЕБ-буфере; ии. тзктиые клетки удаляются осзждеиием в течение 5 мии при 5000 и. зом в присутствии ДСН, белки нужно отделить от тритона Х-100 осаждением в этаноле, как описано ранее. В пробу и в верхний электродный буфер необходимо добавить большой избыток ДСН, в противном случае тритон Х-100 будет образовывать с ДСН смешанные мнцеллы и мешать разделению белков в гелях. 5.3.2.
Внутренняя н наружная мембраны Клетки разрушают на прессе Френча н отделяют клеточный экстракт от целых клеток центрифугироваиием при 5000 и в течение 5 мин, как описано ранее. Фракцию клеточных оболочек осаждают цеитрифугироваиием при 200000 д в течение 1 ч, а осадок ресуспендируют в з полтчаннв клвточных вглкцип 0,01 М НЕРЕЗ-буфере, рН 7,4, так чтобы получить концентрацию белка -20 мг/мл. Градиенты сахарозы готовят на этом же буфере.
Для ротора Вескшап 5% 27 (объем стакана 37 мл) мы используем 5 слоев по 7 мл каждый, содержащих следующие количества сахаровы (вес/вес): 35, 40, 45, 50 и 55%. 2 мл суспензии с оболочками наслаивают поверх градиента и центрифугируют при максимальной скорости (131000 н) 35 — 48 ч. Небольшое количество осадка на дне стакана удаляют. Наружные мембраны содержатся либо в одиночной мутной полосе, либо в паре сходных полос в положении, соответствующем концентрации сахаровы примерно 52% (вес/вес). Фракция цитоплазматических мембран представляет собой прозрачную желтоватую полосу в том месте, где сахароза имеет концентрацию около 36$ (вес/вес).
Градиенты разливают с помощью насоса и измеряют поглощение фракций при 280 нм. Затем собирают и объединяют фракции, содержащие мембраны, объединенные фракции разводят в соотношении 1:3 тем же НЕРЕЗ- буфером, который в данном случае содержит 1 мМ МнС1,, и центрифугнруют при 200000 д в течение 2 ч для осаждения частиц мембран. Для выявления перекрестного загрязнения можно воспользоваться различными биохимическими маркерами.
Цитохромы и сукцннатдегндрогеназа представляют собой подходящие маркеры для фракции цитоплазматнческих мембран. Белки наружной мембраны, называемые «главнымн» [!] и выявляемые в ДСН-полиакриламидных гелях, †полезные маркеры для наружной мембраны, так же как н специфические липополисахариды или фосфолипазы 18). Наилучшие результаты мы получили на культурах, выращенных на минимальных средах с временем генерации -1 ч и более. Мембраны клеток, вырапгенных на комплексных средах, по-видимому, труднее разделить, возможно, вследствие увеличения числа зон адгезии между наружной и цитоплазматической мембранами в быстрорастущих клетках. 161 ЧЛСТЬ 1.
МОРФОЛОГИЯ 5.4. ЛИТЕРАТУРА 1. Ваы(огй Р. У„Уг., В|ейг!сй В. У,, Всйиш!таа С. А., Кесаев Р. Ои$ег гае|пЬгапе рго!е(пз о1 Еьсйеггсй(а соП. Ч1. Рго1с1п а11ега1юп (и Ьас1ег1орйаие-гез!ь1ап! тЫап1з. У. Вас1епо1., 131, 608 — 622 ($977). 2, Ршгваайя 0„51есй 7. У., руаПасй В.
Е Е1ес1горйогеИс апа!уз(в о1 1Ье та!ог ро1урер1Ыея о$ |Ье Ьп|иап егу!Ьгосу1е тегпЬгапе. В1осйе|п!ь!гу, 1О, 2606 — 2617 (197!). 3. Не!еа!иь А., 53тоаь К. Зо!иЬ~!ЫаИоп о$ |пе|пЬгапев Ьу йе1егдеп1з. В(осй(ю. ВюрЬув. Ас1а, 4!5, 29 — 79 (1975). 4 Ниуйея В. Е., 27!треплу У, Зг. Т., Е!суй В. ТЬе й(в(п1еига1$оп о1 ю(сгоогиап(ьюв, р. 1 — 54. 1п: У. К. Ь(огг!з апй $). ТЧ.
К(ЬЬопв (ей.), Ме!Ьойв (и юкгоЬ|о!оду, чо1, 5В. Асайе|и!с Ргезв, 1пс., $4евг Уог)г, 197!. 5. йаетту (У. С!еачаие о! з1гис!пга! рго1е(пз йиг(пд аввеюЫу о1 Ьас1сг!орйаае Т4. Ь(а(иге (1.опйоп), 222, 293 — 298 (1970). 6, Мас6геуог С. Н., ВсйааПтаа С. Кесопв(Ии!$оп о$ пИга(е гейис(аве асИч!(у апй (оппаИоп о1 |иеп|Ьгапе рагИс!ев (гоги су!ор1аью!с ех1гас!ь о1 сйо(а1с-геь1Ыап1 иш1ап1в о( Еясйег!сЫа соП.
У. Вас1епо!., 1!4, !!64 †11 (1973). 7. Неи Н. С., Нерре! Е А. ТЬе ге1еазе о( епху|иев 1гогп Еьсйег!сЫа сой Ьу оьюо1$с зйос)г апй йиг(пи 1Ье (оппа1юп о! врЬегор!авЫ. У. В(о1. СЬегп., 240, 3685 †36 (1965). 8. ОяЬога М У., Мииьал К. ЗерагаИоп о$ !Ье |пиег (су1ор)авппс) апй оЫег |иегпЬгапеь о! Ягагп педаИче Ьас!епа. Ме(йойв Епьугио!, 3!А, 642 †6 (1974). 9. Коза У. 27. Соп1$пиоив-Ио|ч гпесйап(са! сеИ Мз(п1еЯга1ог. Арр!. М!сгоЬ~о1., 11, ЗЗ вЂ” 35 [1963). 10. Ва((оа М, К. 1во1абоп о$ се!1 ъаИз !гоги исаю роЫИче Ьас(епа Ме!Ьойв Епаугпо1., 31А, 653 — 667 (1974). !1. Всйаесй!ег!е б. Е., Роуасй К. Е.
А Ыгпр!И(ей гие(йой $ог циап!И1ей аззау о! з|иаИ а|иоип1з Ы рго(е(п 1и Ь(о!ои(са! |па1ег1а!. Апа!. В1осйегп., 51, 654 — 655 (1973). 12 В!е!лЬегу 57. РгорегИез апй йече!оргпеп(а1 го!ез о! 1Ье !узу1- апй (гур1орйапу1-1гапв$ег г)Ьопис(е!с ас(й зуп(йе1азев о$ Вас!Пыя яиЬНПя| сопапоп пепе!(с спи!и о((йе соггевропйпд враге апй чеие!а. Иче епаугпез. У. Вас1епо$, 118, 70 — 82 (1974), 13.
Вуйея У. Сеп1п(иуа! 1есйп!Чаев !ог (йе $зо!аИоп апй сйагас(ег|ьаИоп о1 виЬ.сеИи!аг сотропеп1з !гоги Ьас1епа, р. 55 — 207, 1и: У. К. Ь(огг(в апй $7. ТЧ. К)ЬЬопв (ей.), Ме!Ьойв $п |п(сгоЬ~о(оиу, чо!. 5В. Асайеги(с Ргсвв, 1ис., $Чеаг Уогй, 197!. 14. (рогй Е СеИ чга1(з, р.
361 — 418. !и: У. К. Р(огг!ь апй $). ТЧ. К!ЬЬопв ей.), Ме!Ьойв |п ю!сгоЬю1оиу, чо1. 5А. Асайеп|(с Ргезв, 1пс., Ь(евг огЫ 1971. Часть 11 РОСТ ВВЕДЕНИЕ Р. Костилои Начиная с изящной работы Роберта Коха, сделанной еще в середине Х!Х столетия, методы выращивания бактерий стали основной заботой бактериологов. Для выращивания различных видов и штаммов микроорганизмов в самых различных целях были предложены буквально тысячи методик и сред. Однако все зти методики базируются на определенных общих принципах.
Для размножения любой бактерии (независимо от целей) необходимо обеспечить подходящее биофизическое окружение и биохимические питательные компоненты. В гл. 6 приведены методы контроля таких биофизических факторов, как рН, температура, подача и удаление кислорода, и другие. В гл. 7 рассмотрены потребности в питательных веществах, состав синтетических и комплексных сред и количественные определения ро. ста бактерий. Умелое обращение с биофизическими, биохимическими и биологическими факторами приобретает особую важность в получении накопительных культур н последующего выделения бактерий в виде чистой культуры (гл.
8). Способы культивирования бактерий значительно различаются, причем зто зависит не только от потребностей организма, но н от того, для чего будет использоваться культура. Для выделения чистых культур, определения числа жизнеспособных клеток в популяциях и для многих других целей широко используются твердые среды.
Гелеобразующие вещества и специальные методы приготовления твердых и полужидких сред рассматриваются в гл. 9. В гл. 10 описываются различные системы для жидких культур: стационарная, или периодическая, проточная, диализная — и другие специальные системы, а также методы сбора, отмывки и учета урожая бактерий. ЧАСТЬ П РОСТ Ростом обычно называют постепенное увеличение всех биохимпческих компонентов индивидуума. Для бактерий наиболее характерным результатом роста является увеличение числа клеток, т.
е. их размножение. В гл. 11 описаны различные методы измерения количества клеток и математические приемы, используемые при учете и статистической обработке результатов. Современные методы хранения чистых культур обсуждаются в гл. 12. Можно было бы составить целый «Журнал невоспроизводимых результатов», в котором были бы собраны данные, свидетельствующие о неумении исследователей сохранять необходимые бактериальные штаммы. В некоторых журналах существует требование, согласно которому каждая использованная в опубликованной работе культура должна быть помещена в какую-либо известную коллекцию.
К сожалению, это не всегда позволяет избежать неудач, поскольку при хранении бактерии мутируют и при частых пересевах культура обогащается мутантными формами. Из многих методов выращивания бактерий авторы выбрали только те, которые, по их мнению, являются наиболее приемлемыми. Там, где это возможно, приведены очень ценные обобщения, главным образом в виде таблиц, включающих составы сред (гл. 7). В некоторых случаях авторы ограничиваются изложением общих принципов и примерами использования методов. Это относится, в частности, и к тем распространенным методам, описания которых в литературе страдают многословием и противоречивостью трактовок. Во всех главах, входящих в данную часть, рассмотрены также наиболее общие причины ошибок.
Глава 6 БИОФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ Р. Костилоу Выбор основных компонентов среды культивирования определяет в известной мере значения таких важных бнофизическнх параметров, как рН, активность воды, осмотическое давление. Температура, аэрация н давление определяются условиями культивирования. Другой важный параметр — окислнтельно-восстановительный потенциал зависит как от состава ростовой среды, так и от условий культивирования.
Все эти факторы влияют на скорость роста, выход биомассы, метаболизм и химический состав бактерий. Контроль щелочно-кислотных условий, температуры и аэрации является критическим для любой бактериальной культуры; контроль окислительно-восстановительного потенциала особенно важен при культивировании облнгатно-анаэробных бактерий. 6.1. рН рН служит показателем активности ионов водорода (Н"). В разбавленных растворах коэффициент активности очень близок к 1, и поэтому активность Нэ практически равна концентрации.
В таком случае рН вЂ” 16(Н~1 Шкала рН начинается от 0([Н~-) =1 М) и заканчивается 14-ю ((Н~) =10 '" М). Хотя некоторые бактерии растут прн рН 1,О, а другие при рН 11, многие виды растут в относительно узком интервале рН, а большинство из ннх — при значениях рН, близких к 7,0. 6.1.1. Измерение Для точного определения рН пользуются рН-метром со стеклянным электродом. В разд 16 2.1 приведено описание водородного электрода, методов, используемых для калибровки рН-метров, н способов обращения с электродами. В работе Манро 191 можно найти детальное вписанне измерения и контроля рН. Когда необхо.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
