Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Хьюджес с соавторами (41 дали полное описание этих методов. Промышленностью выпускается аппарат для измельчения замороженной клеточной массы икс-пресс (!.КВ-Ргодпк!ег АВ, Вгопнпа, Ятчебеп), в котором эффективно разрушаются как грамположительные, так и грамотрнцательные клетки, Однако этот аппарат имеет ограниченную емкость, относительно дорог и сложен в работе. К тому же у него нет особых преимуществ перед прессом Френча или дезинтегратором Брауна. 5.1.5.
Обработка мурамидазами Для приготовления протопластов грамположительных бактерий используют яичный лизоцим. Обычно гидролиз этим ферментом проводят в растворе сахарозы (0,3 — 0,5 М) при нейтральном или слабощелочном значении рН. Обработка лизоцимом в концентрациях от О,1 до 1,0 мг/мл в течение 30 мин должна приводить к 100%-ному образованию протопластов. Для контроля этого процесса применяется фазово-контрастная микроскопия. Протопласты стабильны при малых концентрациях Мдз+ и Саз~ (в диапазоне 0,5 — 5 мМ). Реакцию гидролиза проводят как на холоду, так и при комнатной температуре.
В продаже имеются препараты мурамидаз, имею. щих более широкую субстратную специфичность, чем яичный лизоцнм; они могут быть очень эффективными ЧАСТЬ ! МОРФОЛОГИЯ при гидролизе клеточной стенки грамположительных бактерий, устойчивых к яичному лизоциму. К этим препаратам относятся лизостафин, мурамндаза из 81арйд1ососгиз з(арйу1О1уИсиз (81пша СЬеппса1 Со., 81. 1 ои(зе, МО) и мурамидаза из Сйа1агорз(з зр.
(М1!ез (.аЬога1ог!ез, 1пс., Е!ЬЬаг1, 1пд.) Работать с этими ферментами следует осмотрительно, поскольку они не так хорошо очищены, как яичный лизоцим, и часто содержат примеси протеаз, липаз или нуклеаз. В отличие от грамположительных бактерий фактическн все грамотрицательные бактерии имеют в своем составе муреип, который чувствителен к лнзоциму.
Однако наружная мембрана грамотрицательных бактерий непроницаема для лизоцима, и для того чтобы лизоцим подействовал, ее целостность должна быть нарушена. Этого добиваются замораживанием — оттаиванием. предварительной обработкой ЭДТА или в некоторых случаях обработкой антибиотиками, действующими па мембраны, такими, как полимиксин В.
Гидролиз муреина в грамотрицательных бактериях не приводит к удалению наружной клеточной мембраны, поэтому образующиеся чувствительные к изменению осмотического давления структуры называют не протопластами, а сферопластами. Сферопласты кишечных бактерий можно приготовить, как описано ниже, по методике Осборна и Мунсона '18). Культуры центрифугируют и суспендируют в О,1 первоначального объема охлажденного 0,75 М раствора сахаровы в 10 ММ трио-ацетатном буфере, рН 7,8.
К пробе добавляют лнзоцим до конечной концентрации 0,1 мг/мл и иикубируют суспензию на льду в течение 2 мин. Перевод клеток в сферопласты осуществляется в ходе медленного разведения суспеизии в течение 8— 10 мин двумя объемами холодного раствора 1,5 ММ ЭДТА, добавляемого посредством перистальтического насоса. Во время разведения суспензию слегка помешивают, а переход в сфсропласты контролируют с помощью фазово-контрастной микроскопии. На Образование протопластов и сферопластов отчетливо влияет ряд факторов, включая фазу роста, на которой собраны микроорганизмы, способы промывания клеток после отбора и тип культуральной среды, В свя- к ползчвнив клвточных фгхкцни зи с описанной выше методикой Осборн и Мунсои 181 отмечают, что клетки, выращенные на комплексной среде, лучше образуют сферопласты, а предварительная ннкубация клеток в холодном буфере до перенесения их в раствор сахаровы сказывается отрицательно на образовании сферопластов.
В целом для приготовления сферопластов или протопластов лучше всего использовать клетки, находящиеся в середине логарифмической фазы роста. 5.1.6. Осмотическое лизирование Сферопласты или протопласты эффективно лизируются прн быстром 10 — 20-кратном разведении разбавленным буфером или дистиллированной водой.
Размер образующихся при этом везикул в определенной степени зависит от быстроты н кратности разведения. Часто применяют методику осаждения протопластов нли сферопластов центрифугированием с последующим суспендированием их в лизирующем буфере. Такие осадки можно быстро и равномерно суспендировать при помощи шприца (в частности, пружинного шприца, снабженного оксфордовским 10х1огб 1.аЬога1ог(ез1 шприцевым пипеттором с иглой большого диаметра нли канюлей.
Несколько энергичных движений поршнем шприца позволяет быстро и равномерно суспендировать смесь. В интактных клетках бактерий дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) включена в структуру нуклеоида. Эта структура стабилизируется рибонуклеиновой кислотой (РНК), и поэтому присутствие следов рибонуклеазы приводит к разворачиванию нуклеоида во время лизиса и образованию очень вязкого раствора высвободившейся ДНК. Трудности, связанные с высокой вязкостью, можно преодолеть несколькими путями. Цепи молекул ДНК можно разрезать короткой обработкой ультразвуком или гомогенизацией суспензии лизированных клеток в ножевом мнкроизмельчителе. Можно также добавить в раствор дезоксирибонуклеазу, но для функционирования этого фермента необходим Мд'~ в концентрации не менее 0,1 мМ.
Если сферопласты лизируются в присутствии ЭДТА, то требуется избыток Мй'~ по сравнению с содержанием ЭДТА. 147 ЧАСТЪ Ь МОРФОЛОГИЯ 5.1.7. Замораживание — оттаивание Замораживание — оттаивание используют для того, чтобы сделать грамотрицательные клетки чувствительными к лизоциму или детергентам.
Этот метод можно применять при выделении мембран или внутриклеточных органелл в больших количествах. Для выделения больших количеств мембран из Е, со- Д полезна следующая методика. Густую суспензию отмытых клеток (клетки составляют около 30 "lо объема суспензии) в 0,02 М трис-буфере, рН 7,8, содержащем 5 мМ ЭДТА, 0,25 М сахарозы и 0,5 мг7мл лизоцнма, помещают в колбу и замораживают в виде тонкого слоя, вращая колбу в ацетоновой бане с сухим льдом. Затем суспензию размораживают, погружая колбу в теплую воду, и, как только все растает, выливают содержимое в 20 объемов холодного буфера, имеющего состав: 0,02 М трис, 0,5 ММ МпС1м 0,1 мг7мл дезоксирибонуклеазы, рН 7,8. Смесь немедленно обрабатывают около 20 с в ножевом микроизмельчителе, чтобы измельчить ДНК и разрушить клетки.
Неразрушившиеся клетки удаляют центрифугированием в течение 5 мин при 5000 и. Если осадка много, его вновь суспендируют в указанном выше растворе трис-ЭДТА-сахарозы и повторяют цикл замораживания — Оттаивания с последующим разведением. Клеточные оболочки, состоящие из наружной и внутренней мембран, получают центрифугироваиием при 27 000 и в течение 20 мин.
5.2. МЕТОДЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ 5.2.1. Дифференциальное центрифугирование Для получения клеточных фракций широко применяются различные виды центрифугирования: дифференциальное центрифугирование, зональное центрифугирование и равновесное центрифугирование в градиенте плотности. Теоретические и практические вопросы, связанные с центрифугироваиием, всесторонне разобраны в обзоре Сайкса 1131. В случае дифференциального центрифугирования образцы центрифугируют определенное время при задан- 148 К ПОЛУЧЯНИР КЛБТОЧИЫХ ФРАКЦИЙ ной скорости, после чего удаляют иадосадочную жидкость. Этот метод полезен для разделения частиц, силь.
ио различающихся по скорости седиментации. Например, цеитрифугироваиие в течение 5 — 10 мин при 3000— 5000 д приводит к осаждению иитактных бактериальных клеток, тогда как большинство клеточных фрагментов при этом остается в надосадочной жидкости. Фрагменты клеточной стенки и большие мембранные структуры можно осадить центрифугироваиием при 20000 — 50000 й в течение 20 мин, в то время как маленькие мембранные везикулы и рибосомы требуют для осаждения центрифугироваиия прп 200 000 и в течение 1 ч. 5.2.2. Зональное цеитрифугирование Зональное цеитрифугироваиие представляет собой эффективный способ разделения структур, имеющих сходную плавучую плотность, но различающихся по форме и массе частиц.
В качестве примеров можно привести разделение субъедиииц рибосом, различных классов полисом, а также молекул ДНК, имеющих различную форму. Центрифугирование осуществляют либо в бакет-роторах, либо в специально устроенных зональных роторах; для предотвращения конвекции при центрифугироваиии в стаканах бакст-ротора или в камере зонального ротора создают слабый градиеит (обычно сахаровы).
Пробу наносят в виде зоны или узкой полосы в самом верху градиеитного столбика. Для субклеточных частиц обычно используется градиент саха- розы от 15 до 40% (вес/объем); большинство этих частиц в достаточной степени разделяется цеитрифугированием при 100000 ц в течение 1 — 4 ч. 5.2.3. Равновесное цеитрифугирование в градиеите плотности При этом виде центрифугирования частицы разделяются по плавучей плотности, а не по скорости седиментации. Метод широко применяется для разделения различных фракций мембран, так как фрагменты мембран, относящиеся к одиому и тому же типу, могут сильно 149 ЧАСТЬ Ь МОРФОЛОГИЯ различаться по размеру (и, следовательно, скорости седиментации), но должны иметь одинаковую плавучую плотность.
Исследуемые компоненты движутся при центрифугировании в градиенте плотности растворенного вещества (для мембран и органелл с плотностью ниже 1,3 г/мл обычно используются сахарозные градиенты, а для более плотных структур, таких, как вирусы, применяют соли винной кислоты и хлористый цезий) до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное положение, при котором плотность каждой частицы равна плотности окружаюгцего раствора.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
