Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 24
Текст из файла (страница 24)
По нашему опыту для обычных целей лучше всего подходит мелкозернистая позитивная пленка (Кодак; 12! ЧАСТЬ ь МОРФОЛОГИЯ 35 мм), если только микроскоп приспособлен для работы с ней. Для камер с фотопластинами мы применяем Кодак Е!ес1гоп 1шаде Нгп № 4489 — пленку в виде листов, сделанную на основе эстара, которая имеет превосходную стабильность размеров и устойчива к разрыву. Она заменяет стеклянные пластины и сходную по свойствам пленку (№ 4463), не поступающую больше в продажу. За более подробными инструкциями следует обратиться к проспекту Кодак 1)а1а Ке1сазе, с.
198, выпущенному вновь в феврале 1980 г., в котором описаны характеристики этой пленки и способы ее проявления. Это вполне естественно, что в любом случае прежде всего необходимо познакомиться с данными и рекомендациями, предоставляемыми фирмой-изготовителем. Затем с опытом придет уменение устанавливать выдерж. ку, проявлять и добиваться на негативе желаемого контраста. Умение фокусировать и получать резкие негативы приходит с опытом, но полезно напомнить, что при больших увеличениях точно установленный фокус не обязательно является лучшим для печатания негатива.
Поэтому неплохо иметь привычку делать 3 — 5 «околофокусных» снимков для каждого нужного поля зрения, пытаясь получить истинный фокус в положении, немного отклоняющемся от среднего. Смещение при каждом шаге меняется от 0,05 мкм (при увеличении на пленке 30 ОООХ) до 0,4 мкм (при увеличении иа пленке 4000Х). При печатании электронных микрофотографий требуется особое внимание к мельчайшим деталям.
Очень важно пользоваться высококачественным увеличителем. Имейте в виду, что увеличители с конденсорами, работающими от точечного источника, передадут каждую царапину, имеющуюся на незмульсионной стороне пленки. Для воспроизводимости полезны автоматические экспонометры, калибрусмые для каждого типа применяемой фотобумаги один раз (например, 1.ес(га РТМ-4Л Пспз(- 1ппег).
Следует иметь широкий выбор фотобумаги, поскольку неизбежна некоторая разница в негативах. Этому удовлетворяет система множественной градации фотобумаги с применением соответствующих светофильтров или набора бромированных типов бумаги с номерами контрастности от 2 до 6. В последнее время участилась 122 к элвктРОИИАя микРОскопия практика поставки бумаги с эмульсией, покрытой специальной смолой (обозначается КС вЂ” от англ. гез1п-соа1ед).
Такая бумага быстро обрабатывается и быстро высыхает, а главное ее достоинство состоит в том, что она не нуждается в глянцевании. В больших лабораториях применяют аппараты для автоматизированной обработки, стабилизированную фотобумагу, увеличители с автоматическим контролем контраста н т, п. Поскольку в разных лабораториях электронные микроскопы, условия съемки, качество пленок и обычные процедуры обработки несколько различаются, мы не будем здесь приводить детальные описания методик Исследователю, осваивающему все это, следует проконсультироваться с опытными исследователями и ознакомиться с приведенными в списке литературы статьями по этому предмету [76 — 82], 4 4.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Микроскопист должен уметь соотносить увиденное им в электронном микроскопе или на электронных микрофотографиях с тем, что уже известно (или не известно) об анатомии бактерий, т. е. уметь интерпретировать свои результаты. Для этого необходимо иметь некоторые знания в исследуемой области; предполагается, что исследователь, собирающийся изучать бактерии с помощью электронного микроскопа, прослушал курс лекций или читал соответствующую литературу н в общих чертах знаком с ультраструктурой микробов.
К сожалению, иллюстрированные атласы, по которым можно легко и быстро сравнивать различные роды и типы микроорганизмов, редки и их трудно найти. К полезным источникам, если только они доступны, относятся атлас, который составили Авакян и др. [53) (текст написан по- русски, а названия бактерий — по-англнйски), статьи в книге под редакцией Фулера и Ловслока [54, 56, 57, 60, 63), работы Гринхала и Эванса по грибам [55$ Ликфелда по бактериям [611, а также Корменди [66) и Ешии с соавторами [70) по сканирующей электронной микроскопии в микробиологии, В дополнение или взамен этого обучаемый может положиться на советы на- 123 часты. мог Ф олог и я ставника в подборе изобилующей ныне литературы по электронной микроскопии бактерий. В точном смысле слова кинтерпретация» может толковаться как извлечение наибольшего количества информации из электронной микрофотографии.
Обычно это относится к деталям тонко организованной, периодически повторяющейся структуры, которая присутствует, например, в жгутиках или дополнительных белковых слоях клеточной оболочки. Для квалифицированной работы получение удовлетворительной микрофотографии †толь первый этап; она включает также методы увеличения изображения н реконструкции, в том числе обработку с помощью вычислительной техники. Для этих методов требуется сложное оптическое и другое оборудование, доступное не для каждой электронно- микроскопической лаборатории, описание которого выходит за пределы поставленных перед данным руководством целей. Интересующиеся могут обратиться за советом к специалистам илн ознакомиться с соответствующей литературой ~76 — 82~. 4.5, ИДЕНТИФИКАЦИЯ Предметом специальных исследований является определение сходства или различий бактериальных анти- генов, а также нх локализации независимо от того, где находятся антигеиы — внутри или на поверхности клетки.
Большое значение имеет также изучение клеточной локализации ферментов и других клеточных компонентов. Для реализации этого полезны методы с применением метки, благодаря которым появляется возможность микроскопически идентифицировать добавленные вещества, выявить их специфическое связывание с другими компонентами илн химические взаимодействия. Существует несколько подобных методов, но большинство нз них требует слишком много времени, некоторые технически сложны, а некоторые редко дают удовлетворительные результаты. Имея все это в виду, мы не будем здесь подробно останавливаться на этих сложных методах, а ограничимся лишь замечаниями относительно их принципов и ссылками.
124 К ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ 4.5,1. Антигены В наиболее широко используемых методах выявления бактериальных антигенов (п зйп применяются фракции антисывороток или антител, меченных флуоресцирующими красителями, такими, как флуоресцеин илн родамин (равд. 1.4.). Связывание, которое происходит исключительно с поверхностными антигенами интактных бактерий, выявляется с помощью оптической темнопольной микроскопии с ультрафиолетовым светом, прошедшим через соответствующие светофильтры, чтобы вызвать характеристическую эмиссию флуорохрома в видимой области. Этот метод очень важен в диагностических и таксономических исследованиях, и поэтому промышленностью выпускается множество меченых антисывороток.
По теории и практике этого вопроса опубликовано много трудов 183 — 85). Принцип использования флуоресцирующих антител был приспособлен и для электронной микроскопии: антитела или гаптены соединяются с электроноплотными веществами (например, с железосодержащим белком ферритином) или такими, которые могут быть сделаны электроноплотными уже после реакции антиген — анти- тело (например, с антителом связывается пероксидаза из хрена, которой после связывания дают возможность реагировать с диаминобензидином).
На практике используется множество комбинаций, включающих анти- сыворотки с различными специфичностямн, фрагменты антител, гаптеиы, а также такие маркеры для визуализации, как небольшие вирусы и т. п. Эти методы, применимые к целым бактериям, позволяют локализовать поверхностные антнгены точнее, чем это делают с помощью оптического микроскопа. Преимущества электронной микроскопии становятся еще более очевидными, когда меченые антитела применяют еще до фиксации, заливки и приготовления срезов, так что метка видна в тонких срезах. В некоторых случаях аналогичным образом метят не антитела, а другие вещества с известной специфичностью: чаще всего применяются лектины растений, такие, как конканавалин А, которые специфично связываются с сахарными остатками 188).
125 ЧАСТЬ ! МОРФОЛОГИЯ Выявление внутриклеточньгх ангигенов 189] в интактных бактериях представляет собой более сложную задачу, чем локализация поверхностных антигенов, так как антитела не способны проходить через интактную клеточную оболочку. Поэтому методы решения задач такого рода опираются прежде всего на приготовление тонких срезов бактерий, переносимых затем на поверхность растворов с мечеными антнтелами, после чего следует промывка, иногда окрашивание и затем исследование с помощью электронного микроскопа.
Главная трудность заключается в выборе среды для заливки, которая должна давать доступ для связывания антителам в водном растворе, В этих целях испробовано много различных веществ (метакрилаты, сшитый альбумин, различные протравленные пластмассы н эпоксидные смолы), но ни одно из них не может считаться удовлетворительным во всех отношениях; в этой области необходимы дальнейшие исследования. Интересующиеся могут получить общее представление о методах и проблемах иммуноцитохимии или иммуноэлектронной микроскопии, изучив предлагаемую литературу [87 †9. 4.5.2. Ферменты Проблема точной локализации ферментативных активностей в той форме, в какой они реализуются в клетке, давно стоит на повестке дня в гистохимии, а ныне— в цитохимии на уровне электронной микроскопии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
