Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Для ферментов разных типов используются различные методы. Это зависит от того, насколько возможно применение искусственных или меченых субстратов, которые в нормальных условиях транспортируются в клетку и вступают в реакцию, образуя продукт, видимый либо в световой, либо в электронный микроскоп. Изучению ферментативных активностей посвящена обширная литература, на которой мы не можем останавливаться изза ограниченного объема настоящего руководства. Необходимую информацию читатель найдет в многочисленных работах, которые публикуются в журналах, посвященных исключительно гистохимии и цитохимии 1861.
с элвктяоннзя мнкгоскопия 4.5.3. Радиоавтография Другая большая область знаний, исследования в которой, подобно использованию меченых антител в гистохимии, перешли с оптического на электронно-микроскопический уровень, посвящена изучению поведения внутри клетки веществ, меченных радиоактивными атомами, нх распределению н локализации. Радиоактивная техника применима к широкому кругу проблем, но в случае бактерий (из-за их малого размера) необходимо особое внимание к условиям опыта и качеству эмульсии, которая должна обеспечивать минимальную зернистость. Принципы и методы техники с применением радиоактивных веществ достаточно полно описаны в ряде книг [92 — 9Я.
4.б. МАТЕРИАЛЫ Поставщики перечисленных ниже материалов обозначены буквами (в скобках) в соответствии со списком, представленным в равд. 4.7. 4.6.1. Материалы для приготовления пленок-подложек Формвар, порошок (и, к, о, т) Растворы формвара (и, к, т) Дихлорэтан (з, и, к, о, п, т) Чистые микроскопические стекла Неволокнистый нротирочный материал (и, к, о, р,) Большие металлические (или пластмассовые) лотки или кюветы Большая стеклянная чашка с вертикальными стенками. Оптимальные размеры 200Х80 мм (культуральная чашка Ч((го; о, у). Крышка должна быть ровной и гладкой.
Дно и стенки постоянно покрыты черной изолентой, чтобы легче было видеть плавающие пленки на черном фоне Черная изоляционная лента Стеклянная палочка, длина которой больше диаметра чашки Стеклянные кюветы Коплина для окрашивания (а, 3, о, у) ЧАСТЬ 1. 1АОРФО 10ГИЯ Пастеровские пипетки и резиновые груши 10%-ная плавиковая кислота в тефлоновом контейнере (з) Бритвенные лезвия, отмытые спиртом Фильтровальная бумага (7К(1а1шап № 1), кружки диаметром 9,0 см (а, з) Стандартные чашки Петри диаметром 9,0 см Ножницы Пинцет для сеток Вшпоп1 № 5 или эквивалентный ему (и, к, о, п, с, т).
(Вокруг основания пинцета можно сделать одну-две петельки из нихромовой проволоки, которые продвигаются вперед для смыкания кончиков пинцета на сетке, что помогает предотвратить случайное выпадение сеток. Если такие петельки сделаны, нет необходимости покупать дорогостоящий пинцет, имеющий специальную конструкцию для захвата сеток.) Медные сетки, предварительно очищенные (е, и, к, л, о, и, с, т) Люминесцентная лампа 4.6.2. Материалы для приготовления углеродных пленок Высоковакуумные испарители и дополнительные принадлежности (б, и, к) 4.6.3. Материалы для негативного контрастнрования Сетки с подложкой, приготовленные, как описано, или купленные (и, к, т) Липкая лента (Типе Таре) (а, з, о) Предметные стекла Зеростат (г, о) Пастеровские пипетки Ацетат аммония (з, и) Молибдат аммония (з, н, т) Фосфорно-вольфрамовый калий (е, и, к, о, п, т) Уранилацетат (е, з, и, к, п, с, т) 4.6.4.
Материалы для фиксации, заливки, приготовления срезов и окраски срезов Глутаральдегид (е,з, и,к,о,п,т) Ыа-какодилатный буфер Е ЭЛЕКТРОННАЯ МНКРОСКОНИЯ Может быть куплен как буфер или как набор заранее отмеренных ингредиентов (т). В другом варианте концентрацию какодилата натрия (е, з, и, к, о, п, т) доводят в воде до 0,2 М, а рН вЂ” до 7,2, добавляя НС1. (Предупреждение какоднлат токсичен; необходимо избегать контакта с ннм и вдыхания содержагцих мышьяк паров ) Веронал-ацетатный буфер Может быть нуплен кан буфер (к, п) или приготовлен из веронала натрия (п) по следующей прописи для исходного концентрированного раствора: Веронал натрия (барбитал натрия) 2,94 г Ацетат натрия, водный 1,94 г Хлорггстый натрий 3,4 г Дистиллированная вода 100 мл Из этого раствора готовит каждый день рабочий буфер: Исходный концентрированный раствор 25,0 мл Дистиллированная вода 96,5 мл 1 и.
НС! 3,5 мл 1 и. СаС!а (110,98 г/л) 1,25 мл В колбу на 125 мл вливают 25 мл концентрированного раствора. К 90 мл воды в мерном цилиндре на 100 мл добавлнют 3,5 мл 1 н. НС! п доливают до 100 мл водой. Этот раствор вливают в колбу с концентрированным раствором, добавляют туда 1,25 мл 1 н. СаС14 и перемешивают.
(Заиечание: если клетки, которые должны промываться в этом буфере, до этого подвергались действию фосфатов пли в культуральных средах, или в фосфатном буфере, необходимо иметь для начальных промывок рабочий буфер, приготовленный без СаС!и чтобы избежать выпадения осадка фосфата кальция. После такой предварительной промывки можно пользоваться полным буфером.) Защитные очки Четырехокись осмия (е, з, и, к, о, п, т) Агар марки )ч(ОЫе (в) Уранилацетат (е, з, и, к, о, п, т) Триптон (в) Триптический соевый бульон (в) Стеклянные кюветы с завинчивающейся крышкой объемом в одну аптекарскую драхму (о, п) Респиратор, чзаз(ое (м) Разовые пластмассовые контейнеры объемом в 4,5 унции (около!30 мл) (а, ж, з) Среда Спарра: Поставляется в аиде набора (и, к, п) нли в виде ингредиентов (т), которые должны использоваться для приготовления исходной смеси, как описано ниже.
!29 ЧАСТЫ. МОРФОЛОГИЯ Исходнал смесел Ейь-4206 (двуокись зннилциклогексана) 30 г или 27,0 мл ВЕк-736 (диглнцидиловый эфир пропилеи- 24 г илн 22,8 мл гликоля, эпоксидная смола) ИВА (нопеиилянтарный ангидрид) 78 г или 76,5 мл Под тягой или надев специальную маску, добавляют все три компонента в указанном выше порндке в разовый контейнер Ра!соп № 4013 с перемешнваннем на магнитной мешалке. В течение 5 мни перемешивают прн комнатной температуре, Эту концентрированную смесь без затвердителя можно хранить в плотно закрытом сосуде при †4 'С 3 — 5 мес. При ганом хранении перед открыванием сосуда и после взятия смеси оставшуюся смесь следует выдерживать в течение времени, достаточного для повышения ее температуры до комнатной, чтобы избежать конденсации воды, способной ее испортить. )7олная смесь; Чтобы приготовить полную смесь, 22 мл концентрированной смеси помещают в разовый контейнер, добавляют 0,24 мл затвердителя 5-1 (диметиламиноэтанола) н перемешивают на магнитной мешалке в течение нескольких минут при комнатной температуре.
(Для каждого бактериального осадка или другого образца, который должен быть залит, но не для каждого агарового нубика, в который заключен объект, следует нспользовзть по крайней мере 6 мл полной смеси. Этого объема хватит для приготовления нужного количества смесей, применяемых на этапах с 4-го по 6-й при проведении обезвоживания и заливки, а также для заполнения трех напсул Вима. Ясно, что если из каждого образца хотят получить больше чем три блока, нужно взять больше смеси. Аналогичным образом, если работа одновременно ведетсн более чем с тремя осаднами нли образцами, начальный объем полной смеси должен быть больше чем 22 мл; последнюю готовит в тех же пропорциях.) Время, в течение которого хранящаяся в контейнере полная смесь может использоваться, составляет всего 2 дня.
Капсулы Бима (каталоговый номер 23200, размер 00) (и, к, о, и, т) Сушильный шкаф Центрифуга Вг!п)апапп 3200 (Еррепдог1). Плоскогубцы Бритвенные лезвия с одним режущим краем Ультрамикротом Стеклянные пластинки Аппарат для изготовления стеклянных ножей Алмазный нож (д) Зубной воск Склянки для взвешивания Пластмассовая чашка для культур тканей, 33Х К100 мм 4. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ Гранулы Ь)аОН Чашки Петри, стеклянные или пластмассовые Цитрат свинца: Выпускается готовый к применению препарат (и, к, о, п, т). Может быть также приготовлен по методу Рейиольдса (Л. Сен В)о!., !7, 208 — 212, 1963), как описано ниже. В 50-миллилитровую мерную иолбу добавляют: Нитрат свинца 1,33 г Нитрат натрия 1,76 г Дистиллированную воду 33,0 г Встряхивают в течение 1 мин и выдерживают при комнатной температуре 30 мин.
Добавляют 8 мл свежеприготовленного ! н. НаОН и разводят водой до 50 мл 4.7. ФИРМЫ-ИЗГОТОВИТЕЛИ а. Сигнп-Ма(козон Бс!епннс, !пс., 10727 Тисйег 51., Венвчн!е, МО 20705 б. (Ген!оп Насиигп !пс., СЬеггу НИ1 !пдиз1па! Сеп1ег, СЬеггу НИ!, ЫЛ 08003 в. асс 1.аЬога1ог!ез, Р. О. Вох 1958А, Ое1гон М! 48232 г. О!зстчазЬег, 1пс., 1407 ЬЬ Ргоч)пенсе Иг) Со!шпЬга, МО 65201 (ог )оса! рЬо(о в!огсз) д. ))ирои! 1пыгигпеп(а, В!огней!са! О!ч)з!оп, Ыетч(оагп, СТ 06470 е. Е!ес1гоп Мкгозсору Бс)епсев, Р.
О. Вох 251, Рог1 Жазыпй(оп, РА !9034 ж. Ра1соп Ьайтчаге О!пМоп, 1950 Ттгннатз Ог., Охпагб СА 93030 з. РВЬег Бс!епаи)с Со., ! Иеайеп! Ьапе, Р. О. Вох 375, Ра!г1ачгп, ЫЛ 07410 и. Егпез( Р. Рина~и, 1пс., Р. О. Вох 444, Бсйепес1абу, Ы'г' 1230! к. Ьабб ИезеагсЬ 1пг)из1пеа, 1пс., Р. О. Вох 901, Вигнпй(оп, )ГТ 05401 л. 1.КВ 1пыпппеп1з, 1пс., 12221 Рагматчп Ог., Рос!гчн1е, МО 20852 м. М!пе Ба1е1у Арр!)апсез Со., РИ(зЬигяЬ, РА 15208 н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
