Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 21
Текст из файла (страница 21)
При обработке молибдатом аммония на фокусирующем экране получают менее контрастное изображение по сравнению с обработкой фосфорновольфрамовыми солями и уранилацетатом, и поэтому для работы с ним требуется некоторый опыт. Однако на негативах, проявленных надлежащим образом, получают очень контрастное изображение с большим набором оттенков, воспроизводимых при печати. Молибдат аммония имеет тенденцию плотно окружать большинство бактерий почти непроницаемым слоем. Поэтому для получения хороших результатов на таких крупных объектах, как клет- К ЗЛВКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ки бактерий, часто требуется окрашивание в течение коротких интервалов времени растворами небольшой концентрации (0,1 — 0,57ь). Ожидаемые результаты Какого рода информацию об основных чертах структуры бактерий можно получить методом негативного контрастированияй Это самый простой и самый быстрый метод, который только можно применить (исключая прямой просмотр, который почти бесполезен из-за отсутствия контраста), и поэтому его следует использовать первым.
Можно быстро определить размер и форму микроорганизмов, подтвердить наличие жгутиков (вероятно, уже предполагавшееся при изучении подвижности) и выявить их расположение и тонкую структуру. Можно детализировать другие поверхностные отростки, такие, как ворсинки и фимбрии, нли убедиться в присутствии слоя слизи или вещества капсулы. Выявляются также различия между прокариотами, окруженными мембраной, но лишенными клеточной стенки (мико- плазмы или Е-формы бактерий), и прокариотами, имеющими клеточную стенку. Природу клеточной оболочки определяют путем разрушения клеток и фракционирования клеточных структур, благодаря чему появляется возможность ясно различить упорядоченную тонкую структуру слоев клеточной стенки.
Этот прием позволяет разделить и сделать видимыми такие компоненты, как мембраны, мезосомы, другие цитоплазматическне мембранные системы, газовые вакуоли, метаболические гранулы, рибосомы, жгутики, ворсинки и т. д, (Гидродниамические силы, возникающие при отборе раствора шприцем или при чрезмерно интенсивном пропускании его через пипетку, могут привести к отрыву жгутиков и ворсинок от клеточной поверхности.) Краситель проникает в периплазматическое пространство между мембраной и клеточной стенкой, и, благодаря тому что он заполняет все образуемые мембраной углубления, выявляются очертания мезосом. Это в свою очередь позволяет быстро (и обычно точно) определить, какую бактерию изучают — грамотрицательную нли грамположительную.
107 ЧАСТЬ П МОРФОЛОГИЯ Негативное контрастирование представляет собой также удобный способ наблюдения за деградацией клеток при нх постепенном разрушении и за изменениями, вызываемыми обработкой такими агентами, как ферменты, антибиотики, поверхностно-активные вещества н т. д. Используемый непосредственно, а лучше после индукции, метод негативного контрастирования незаменим при быстром обнаружении лнзогенного состояния путем нахождения бактериофагов или еще ие собранных их компонентов, что имеет большое значение при изучении ультраструктуры и стадий развития вирусов, а также взаимодействий вируса с клеткой-хозяином. Результаты негативного контрастирования и других способов анализа с помошью трансмиссионной электронной микроскопии можно найти в работах, список которых приведен в конце главы [53 — 631. 4.1.2.
Приготовление срезов 134 — 431 Прокариотнческие клетки, которые собираются анализировать с помощью срезов, должны быть химически фиксированы, промыты и обезвожены для заливки в материал, способный прочно затвердевать. После заливки можно нарезать очень тонкие срезы, затем обработать препарат растворами солей тяжелых металлов н исследовать в электронном микроскопе, Хотя применяются многие различные комбинации, мы считаем, что в целом достаточно использовать фиксацию в глутаральдегиде и четырехокиси осмия или только в четырехокнсн осмия с последующей заливкой в среду Спарра 1431. Имеется целый набор пластических материалов для заливки, но для обычных целей вполне подходит среда Спарра.
Осмий-глутаральдегидная фиксация 1. К клеточной суспензни или жидкой культуре добавляют равный объем 5%-ного глутаральдегида в 0,2 М 1Ча-какодилатном буфере, рН 7,4 (конечная концентрация глутаральдегнда 2,5% ). В другом варианте клетки центрифугируют и суспендируют осадок в 2,5%-ном глу- ь элвктвонихя микеоскопия таральдегнде в какодилате. (Какодилат токсичен; поставщики и прописи для этих и других веществ приводятся в равд.
4.6 и 4.7.) Перед этим этапом проводят отмывку в свежей среде или соответствующем буфере. Для некоторых прокариот, особенно некоторых мико- плазм, лучше отказаться от какодилата и готовить глутаральдегид в разных концентрациях на свежей культуральной среде, чтобы сбалансировать осмотические свойства и (или) рН. 2. Пробы фиксируют 2 — 3 ч при комнатной температуре.
В действительности время можно варьировать: обычно достаточно любого интервала больше 20 мии. (Мы с успехом подвергали обработке бактерии, путешествовавшие через всю страну в глутаральдегиде в течение нескольких дней.) 3. Осадок дважды промывают в веронал-ацетатном буфере Келенбергера с помощью центрнфугирования. 4. Промытый осадок суспендируют в 17о-ной четырехокиси осмия и оставляют на 6 — 16 ч при комнатной температуре.
(Фиксированный глутаральдегидом осадок перед проведением этого этапа можно заключить в агар: см. этапы 6 — 8.) Предупрезсдениеч работать с летучими и токсичными фиксаторами и другими веществами следует под тягой или по крайней мере надев очки н респиратор, чтобы защитить эпителий роговицы и дыхательных путей. Если чувствуется запах четырехокиси осмия, глаза могут подвергнуться опасному воздействн:о паров, Для того чтобы исключить возможность повреждений, в лаборатории в определенном месте должен находиться комплект для промывки глаз (Ма1де Со 1, используемый в случае необходимости. 5.
Центрифугируют и промывают почерневший осадок, вновь суспендируют его в веронал-ацетатном буфере и еще раз центрифугируют. 6. Готовят 2'!о-ный агар марки «Ной)е» на вероналацетатном буфере и охлаждают его до 45'С. Добавляют к осадку 2 — 3 капли этого агара и быстро перемешивают при помощи теплой пастеровской пипетки. 7. Этой же пипеткой суспензию быстро разливают по очищенному спиртом предметному стеклу и дают агару застыть. Бактерии должны находиться в достаточной концентрации и быть равномерно распределенными. Чи- чзсть ь мОРФОлогия етым бритвенным лезвием из застывшего агара нарезают кубики с ребром 1 мм. 8.
Кубики суспендируют в 0,5%-ном водном уранилацетате и оставляют при 4'С на 16 ч. [Раствор уранилацетата нужно профильтровать (фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, М1111роге Согр.), чтобы предотвратить кристаллизацию при этой температуре.) Осмиевая фиксация 1. Центрифугируют клеточную суспензию или культуру.
2. Осадок промывают, суспендируют его в свежей культуральной среде или веронал-ацетатном буфере, центрифугируют и суспендируют в среде с триптоном нли в триптическом соевом бульоне. (Применять эти растворы не обязательно, но обычно они улучшают выявление рибосом и нуклеондов 158, 59, 62).) 3. Взвесь центрифугнруют и суспендируют осадок в 0,1%-ной четырехокиси осмия, приготовленной на веронал-ацетатном буфере. Фиксацию проводят в течение 2 — 4 ч при комнатной температуре. 4.
Дальше поступают так же, как на описанных вы. ше этапах, с 3-го по 8-й. Обезвоживание и заливка средой Спарра 1. Обработанные уранилацетатом агаровые кубики дважды помещают для промывки в 70%-ный этанол, каждый раз на 15 мин. Делают это в кювете на 4,5 мл (одна аптекарская драхма), используя 2 — 3 мл этанола. 2.
Последовательно промывают пробы в 80%-ном и 95%-ном этаноле, по 15 мин в каждом. 3. Пробы помещают в 100%-ный этанол на 30 мин. 4. Этанол сливают и к пробам вновь добавляют 1 мл свежего 100% -ного этанола, Затем вносят 1 мл полной среды Спарра и смесь тщательно, но осторожно перемешивают. В этих условиях пробы оставляют на 30 мин, время от времени перемешивая, или до тех пор, пока кубики не осядут на дно кюветы (среду легче всего удалять, применяя разовые пластмассовые шприцы.) С ЭЛЕКТРОИНАЯ МИКРОСКОПИЯ 5. Добавляют 1 мл среды Спарра и повторяют операцию.
6. Заменяют среду на новую (2,0 мл) и оставляют на 1 — 2 ч, пока кубики не осядут на дно. 7. В капсулы Бима размером 00 вкладывают типовые метки (в соответствующем держателе) и заливают в каждую один и тот же объем полной среды Спарра. (Мы заливаем 0,55 мл, чтобы окончательно получающийся блок точно входил в зажим микротома фирмы 1КВ.) 8. При помощи заостренной деревянной палочки в каждую заполненную капсулу помещают по одному пропитанному кубику (6-й этап) . Кубик должен опуститься на дно капсулы через 1 мин. 9. Капсулы со снятыми крышками (чтобы обеспечить улетучивание остатков любого растворителя) помещают в сушильный шкаф при 70'С на 16 ч для полимеризации.
Сразу после вынимания из шкафа блоки, образовавшиеся в капсулах, могут показаться слегка мягкими, но они приобретут оптимальную для резки твердость через 2 — 4 ч при комнатной температуре. Другие фиксаторы и среды для заливки Для специальных целей разработано много разных фиксаторов, применяемых в различных комбинациях и разной последовательности. К ним относятся перманганаты и различные альдегиды, принципы использования которых, включая эффекты, зависящие от рН, буферов, ионной силы, концентрации, температуры и длительноси фиксации, обсуждаются в многочисленных книгах 134 — 391.
Для заливки применяют очень много сред 134 — 391 по отдельности или в смесях, причем выбор среды отчасти зависит от того, какая из них доступна. Чаще всего, вероятно, применяется эпон 812 (хотя есть сведения, что он вскоре не будет поставляться производящей его фирмой, а будет заменен подобными средами, выпускаемыми другими фирмами). Для заливки используются также дуркупан, аралдит, мараглас, вестопал, для специальных целей различные метакрилаты и множество эпоксидных смол. Подробное описание свойств этих сред и советы по их применению читатель ЧАСТЫ, МОРФОЛОГИЯ найдет в соответствующей литературе.
Мы остановились здесь на детальном описании единственной методики, которая является наиболее удовлетворительной. Подготовка блоков Перед тем как делать срезы, застывшие блоки, находящиеся в капсулах Бима или в капсулах других типов, следует вынуть и довести до подходящих размеров и формы. Заливать можно в плоские желатиновые капсулы или в специальные плоские формы, и в соответствии с этим существуют различные методы подготовки блоков 1421. Новейшие модели микротомов часто содержат устройства для подготовки блоков; такие устройства выпускаются также отдельно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
