Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Усилия, связанные с качественным приготовлением образцов и тщательным выполнением методических требований, а также настойчивость и экспериментальное искусство в работе с электронным микроскопом будут вознаграждены хорошими микрофотографиями и должны быть по достоинству оценены как научным руководителем, так и самим микроскопом. Ценность электронного микроскопа заключается в его способности разрешать объекты, которые не разрешаются оптическим микроскопом в видимом или ультрафиолетовом свете. Короткая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет разрешать, т.
е. различать как отдельные объекты, отстоящие друг от друга всего на 2А (0,2 нм или 0,0002 мкм) или даже меньше, в то время как предел разрешения световой оптики лежит вблизи 0,2 мкм (оп зависит от длины волны используемого света). На практике самые лучшие современные электронные микроскопы просвечивающего типа в самых оптимальных условиях работы (т. е. при при соответствующих вакууме, центрировке линз, ускоряющем напряжении, чистоте прибора, физической стабильности и качестве приготовленного образца) дают разрешение в диапазоне 0,5 — 1,0 нм.
Но биологические образцы имеют вполне определенную толщину; реально предел разрешения для срезов достигает около 2,5 нм, а для негативно контрастированных препаратов — около 1,0 нм. Чтобы улучшить разрешение, нужны мастерство и хорошо налаженный прибор. Образцы и поддерживающие пленки-подложки с большой толщиной увели- Ь ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ чивают рассеивание электронов, что ведет к заметному ухудшению разрешения, Полезно перечислить некоторые ограничения электронной микроскопии.
В связи с тем что образцы исследуются в условиях высокого вакуума, необходимого для получения пучка электронов, они, очевидно, должны быть неживыми и высушенными. Природа проникновения пучка электронов в биологический образец и прохождения через него такова, что степень контраста на фотографии или при непосредственном наблюдении мала и в противоположность разрешению падает с увеличением ускоряющего напряжения.
Следовательно, образец должен иметь минимальную толщину и его необходимо селективно окрашивать или контрастировать солями тяжелых электроноплотных металлов. Поскольку электронный микроскоп обладает повышенным разрешением по сравнению со световым, оказалось возможным получить на нем значительно большее полезное увеличение. В современных электронных микроскопах достигается огромное прямое увеличение изображения на смотровом экране или фотопленке, но для большинства образцов, если не ставить целью разрешить отдельные макромолекулы, вполне удовлетворительны увеличения на экране или пленке 5000 †ОООХ (последующего увеличения в 5 — 10 раз при фотопечати негативов более чем достаточно); при этом обычно получают стабильные изображения.
Качество результатов зависит не только от уже упомянутых условий работы, но также от способа приготовления образцов, мастерства в управлении прибором и от фотографической техники. Благодаря высокому разрешению, наличию различных препаративных методов и большому выбору соответствующей техники микроскопирования удается выявлять детали бактериальных структур, Например, с помощью солей тяжелых металлов, окружающих бактерию и проникающих в поверхностные неровности, получают контрастирование за счет дифференциальной задержки электронов. Этот эффект, известный как негативное контрастирование, аналогичен эффекту применения нигрозина в световой микроскопии.
Однако, если в клеточной стенке или мембране нет разрывов, позволяющих ЧАСТЫ. МОРФОЛОГИЯ проникать контрастирующему красителю, с помощью этого метода нельзя увидеть никаких структур внутри цитоплазмы. В этом случае клеточные компоненты изучают после специального разрушения клеток, фракционирования структур и последующего негативного контрастирования. Детали внутреннего строения 1п зйц выявляют на срезах бактерий, залитых в полимерный материал; предварительно бактерии фиксируют химически и обрабатывают солями тяжелых металлов для получения необходимого контраста. Часть электронов проходит через образец, а другие рассеиваются компонентами структуры, в результате чего формируется изображение на люминесцирующем смотровом экране или пленке.
Электронный микроскоп, в котором изображение получают благодаря прохождению (просвечиванию) электронов (по крайней мере части из них) через образец, называют просвечивающим (или трапсмиссионпым). Такие микроскопы обладают самыми широкими возможностями применения в микробиологии (53 †6. Благодаря техническому прогрессу недавно появился также сканирующий (растровый) электронный микроскоп. Некоторые современные модели электронных микроскопов устроены так, что сочетают в себе возможности как просвечивающего, так и сканирующего микроскопов, и их можно переоборудовать с одного типа на другой. При сканирующей электронной микроскопии, как следует из названия, пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране; этот процесс сходен с формированием телевизионного изображения. Образец прежде всего фиксируют химическим путем, высушивают в критической точке, чтобы избежать деформации и напыляют в вакууме золотом или другим тяжелым металлом.
Разрешение, достигаемое с помощью сканирующего электронного микроскопа, заметно улучшилось со времени его появления, но оно до сих пор меньше (в лучших выпускаемых промышленностью образцах около 3,0 нм), чем в обычных просвечивающих электронных микроскопах. Сканирующий электронный микроскоп дает только картину поверхностей, но позволяет полу- и элвктгоннкя мнкгоскопйя чать сразу трехмерное изображение, поэтому отпадает необходимость трудоемких процедур приготовления реплик интактных, фрагментированных или полученных замораживанием — скалыванием клеток бактерий, обязательных в случае трансмиссионной электронной микроскопии.
В бактериологии [64 †7 сканирование наиболее эффективно с целью выявления отростков и других поверхностных структур, для определения формы и топографических отношений как в колониях, так и на поверхностях инфицированных тканей. В этой главе описывается небольшое число методов, которые мы в соответствии с собственным опытом считаем полезными для исследователя, изучающего анатомию бактерий. Мы делаем акцент на применении негативно контрастированных препаратов и тонких срезов образцов для анализа в просвечивающем электронном микроскопе. Здесь нет описания операций по управлению и эксплуатации электронного микроскопа [15 — 19], но есть краткая информация о необходимых для работы материалах и их поставщиках (равд. 4.6 и 4.7).
Предполагается, что доступны вспомогательные приборы и что помощь в работе могут оказать опытные операторы. Мы поставили своей целью снабдить обучающегося сведениями о методах приготовления образцов и способах интерпретации результатов. Хотя помимо методов и оборудования, на которых делается акцент, будут упоминаться и другие, детальную информацию о них можно найти, лишь обратившись к специальной литературе, другим руководствам и журнальным статьям.
В конце главы мы приводим литературу по общим вопросам [1 — 141 и перечень источников специальной информации. 4.1. ПРОСВЕЧИВАЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ 4.1.1. Негативное контрастирование [20 — 331 Микроскопические сетки [20 — 231 Для электронной микроскопии промышленностью выпускаются стандартные сетки диаметром 2,3 или 3,0 мм. Они изготовляются из различных металлов и ЧАСТЬ Ь МОРФОЛОГИЯ имеют разную частоту ячеек; наиболее распространен вариант медных сеток с частотой ячеек 200 меш (частота в мешах обозначает число рядов в сетке на расстоянии в один дюйм). Одна сторона у сеток матовая, а другая — блестящая.
Перед нанесением поддерживающих пленок-подложек сетки следует очистить, обработав их для этого ацетоном или какими-либо другими растворителями. Однако некоторые предприятия-изготовители выпускают уже достаточно очищенные сетки, которые можно дополнительно не обрабатывать. Пленки-подложки,'120 — 23] Хотя для поддержания объектов, залитых в эпоксидные смолы (см. ниже), можно использовать сетки без пленок-подложек, жидкие образцы для негативного контрастирования нужно помещать на пленки-подложки, покрывающие сетки. Обычно это нитроцеллюлозные или коллоидные (парлодиевые), поливннилформоловые (формваровые) или углеродные пленки.
Пленки из первых двух веществ, относящихся к пластмассам, часто стабилизируют дополнительным тонким углеродным слоем. Формвар — наиболее удовлетворительный материал для пленок-подложек, и мы рекомендуем следующий способ его применения. 1. Приобрести материалы, перечисленные в равд. 4.6.1. 2. Приготовить рабочий 0,2%-ный раствор формвара в дихлорэтане, используя исходный концентрированный 0,5%-ный раствор и указанный растворитель. 3.
Отмыть предметные стекла мыльным раствором (или раствором детергента) и водой и тщательно промыть их дистиллированной или деиоиизованвой водой. Высушить стекла, пользуясь как промокашкой неволокнистым протирочным материалом, ни в коем случае не прибегая к протиранию, чтобы избежать наведение заряда статического электричества.
Чистые стекла можно хранить по отдельности, проложив между ними кусочки неволокнистого протирочного материала. 4. Наполнить одну кювету Коплина (Сор!(п )аг) рабочим раствором 0,2%-ного формвара, а в другую внести 4 — 5 капель днхлорэтана и накрыть ее. В последней «ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ создается атмосфера растворителя, что способствует равномерному высыханию предметных стекол, покрытых формваром. 5. Поместить два или три предметных стекла в кювету с раствором формвара и оставить их там на 3 — 5 мин. Вынуть стекла по одному и перенести во вторую кювету для «высушивания».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
