Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Раствор перемешивают и оставляют стоять несколько дней. Перед использованием его фильтруют. Ристеоритель для обесцвечивания: Зтанол 95%-ный (объем/объем) Соляная кислота (ионпентрированная) Дополнительный кросителгк Метиленовый синий, солянокислая соль Дистиллированная вода 0,3 г 100 мл 71 Методика: 1. Предметное стекло с высушенной иа воздухе и фиксированной прогреванием бактериальной пленкой помещают на держатель для предметных стекол, находящийся над кюветой. Погружают пленку в карболфуксиновый краситель. Предметное стекло осторожно подогревают снизу на горелке Бунзена или на горячей пластине до отхождения паров (не допускать кипения!). В этих условиях препарат держат б мин, периодически подогревая его по мере надобности (перегрев вызывает разбрызгивание краски н растрескивание стекла).
Пленку промывают слабой, идущей под углом струей водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке. 2. Пленку погружают в обесцвечивающий раствор и сразу же отмывают водой из-под крана, как описано выше, Обесцвечивание и отмывку повторяют до тех пор, пока пленка на внд не станет бледно-розовой. 3. Погружают пленку на 20 — 30 с в дополнительный краситель, отмывают водопроводной водой, как описано выше, подсушивают промокательной бумагой и смотрят в микроскоп. ЧАСТЫ МОРФОЛОГИЯ Кислотоустойчивые бактерии выглядят красными, а все остальные — синими.
Кислотоустойчивость того или иного организма можно также определить флуоресцентным методом. У этого метода есть одно преимущество, заключающееся в том, что стекла с образцами, в которых подозревается присутствие, например, микобактерий, можно просматривать под объективом с увеличением 60Х, а не 100Х; следовательно, все стекло целиком можно просмотреть за короткое время. 0,5 г 99,5 мл Методика: 1. Погружают слегка фиксированную нагреванием бактериальную пленку на !3 мин в реактив для флуоресцентной окраски при 20 — 37'С.
2. Промывают пленку под слабой, падающей под углом струей дистиллированной воды, пока сток не станет бесцветным. 3. На 2 — 3 мин погружают пленку в обесцвечивающий растворитель, затем промывают дистиллированной водой, как описано выше. 4. Погружают пленку в дополнительный краситель на 2 — 4 мин. 72 Метод Труаита окрашивания иа кислотоустойчивость 1131 Реактив длл флуоресцентной окраски: Аурамин О, С! 41000 1,50 г Родамин В, С! 749 0,75 г Глицерин 75 мл Фенол (кристаллы, расплавленные при нагревании) 1О мл Дистиллировавная вода 50 мл Оба красителя тщательно перемешивают с 25 мл воды и фенолом. Затем добавляют оставшуюся воду н глицервн и снова перемешивают.
Получившийся реактив для флуоресцентной окраски фильтруют через стекловату и хранят при 4 'С или при комнатной температуре. Растаоритель длл обесцаечивания: Зтаиол 70ьй-ный (объем/объем) 99,5 мл Соляная кислота (концентрированная) 0,5 мл Дополнительный краситель: Марганцовокислый калий Дистиллированная вода з методы иденти»икании В световой микРОскОпии 5. Отмывают дистиллированной водой, как описано выше, и подсушивают промокательной бумагой.
Просматривают образцы в люминесцентный микроскоп с использованием возбуждающего светофильтра ВО-12 и запирающего светофильтра 00-1. Клетки кислотоустойчнвых бактерий флуоресцнруют желто-оранжевым светом на темном фоне. 3.3.7. Эндоспоры Неокрашенные эндоспоры живых бактерий имеют при наблюдении в обычный микроскоп черное обрамление и ярко светятся в плоскости, находящейся немного выше положения истинного фокуса. Не следует считать, однако, что любая сильно преломляющая свет структура внутри бактерии — это эндоспора, особенно если отсутствует информация о теплоустойчивости (разд.
20.!.62). Прямой тест на присутствие эндоспор возможен благодаря явлению, которое наблюдается 1121 во многих эндоспорах после погружения в окислитель в кислой среде (например, 0,1 /Р-ный КМпО, в 0,3 н. НХО» или 0,3 и, НС1). При этом оболочка споры теряет целостность, а часть ее протоплазмы, теперь легко окрашнваемая основными красителями, выпячивается наружу через образовавшуюся брешь. Из-за поразительной сковотечности происходящего события (менее 20 мин пребьь вания в растворе окислителя) этот тест заслуживает названия «проверки на лопанье» (рорр1пд 1ез(). Его удобно проводить, помещая высушенную на покровном стекле пленку спор на 10 — 20 мин в раствор окислителя; «лопнувшие» споры видны без окраски, хотя последняя делает их более легко различимыми.
Имеется несколько удовлетворительных методов для окрашивания эндоспор в бактериях. Прн использовании простейшего из пих — негативного окрашивания — получают нефиксированные препараты, материал которых имеет негативный вид. Для осуществления метода взятый петлей 77",-ный (вес/объем) водный ннгрозин смешивают на покровном стекле с набранной петлей культурой, смесь распределяют в виде тонкой пленки и высушивают на воздухе.
Покровное стекло переворачивают пленкой вниз, помещают па предметное стекло и 73 чхсть ь мОРФОлОГия закрепляют в нескольких местах свечным воском. Эндоспоры выглядят, как сильно преломляющие свет сферические или эллипсоидальные образования, находящиеся как внутри, так и за пределами клеток бактерий 1121. Эндоспоры очень устойчивы к простому окрашиванию, но, будучи однажды окрашенными, они довольно устойчивы и к обесцвечиванию. Полезным методом позитивного окрашивания бактериальных эндоспор является метод Дорнера. Метод окрашивания эидоспор по Дориеру 1. Образец, фиксированный нагреванием на предметном стекле, высушивают на воздухе и покрывают его квадратным кусочком промокательной бумаги или салфетки, подогнанным по размеру стекла.
2. Насыщают бумагу раствором карболфуксина (разд. 3.3.6) и выпаривают его 5 — 10 мин, как описано выше, поддерживая влажное состояние добавлением красителя по мере надобности. Выпаривать можно н по-другому, помещая стекла на штатив, находящийся над емкостью с кипящей водой. 3. Удаляют промокательную бумагу и обесцвечивают пленку смесью кислота — спирт в течение 1 мин; промывают водопроводной водой и подсушивают промокательной бумагой.
4. Высушивают тонкий, нанесенный на предметное стекло слой водного насыщенного раствора нигрозина и просматривают стекло в микроскоп 1раствор ннгрозина готовят следующим образом: смесь 10 г нигрозина и !00 мл дистиллированной воды погружают на 30 мин в кипящую воду, охлаждают и для лучшего хранения добавляют 0,5 мл формалина; перед использованием смесь фильтруют) .
Вегетатнвные клетки бесцветны, эндоспоры окрашены в красный цвет, а фон — в черный. В модифицированном методе Дорнера в пробирке смешивают водную суспензию бактерий с равным объемом карболфуксина. Пробирки опускают на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем набранный петлей 7з7А-ный водный нигрозин смешивают на покровном стекле с небольшим количеством (одна петля) подвергшейся нагреванию суспензии бактерий; после подсушн- к мвтоды идвнтиэиклции в сввтовон микроскопии вания на воздухе образуется тонкая пленка. Результаты получают те же, что указаны выше, но методика менее трудоемкая. Метод окраски зндоспор по Шеферу — Фултону В атом методе вместо карболфуксина применяется 0,5е)в-ный (вес/объем) водный малахитовый зеленый.
Образец высушивают на воздухе на предметном стекле, фиксируют нагреванием, покрывают промокательной бумагой или бумажной салфеткой, пропитанной до насыщения красителем, и помещают на 5 мнн над кипящей водой. Стекло промывают водопроводной водой и бактериальную пленку дополнительно окрашивают 30с сафранином, как в случае окраски по Грану, Затем вновь промывают и подсушивают пленку промокательной бумагой. Эндоспоры окрашиваются в ярко-зеленый цвет, а всгетативные клетки — в красно-коричневый. 3.3.8.
Цисты Бактериальные цнсты, имеющиеся у видов АгогоЬас« )ег например, прн простом окрашивании прокрашиваются слабо; обычно они выглядят, как сферические тела, окруженные толстыми, но плохо прокрашенными стенками. Описанный ниже метод [141 пригоден для выявления цист азотобактера, в том числе форм, образующихся до созревания цист. Окрашивание цист Реактив; Ледяная уксусная кислота 8,5 мл Сульфат натрия (безводный) 3,25 г Нейтральный красный 200 мг Светло. зеленый 5.г, желтоватый 200 мг Этанол 953е-ный (объем/объем) 50 мл Дистиллированная вода 100 мл Все химические реагенты н красители добавляют в воду при постоянном переиешиванни в течение 15 мин и затем смесь фильтруют через мембранный фильтр (с диаметром пор 0,5 мкм).
Методика: Реактив наносят на образец и просматривают влажный препарат под микроскопом. Вегетативные клетки азотобактера окрашиваются в желтовато-зеленый цвет; 75 ЧАСТЬ Ь МОРФОЛОГИЯ на ранних стадиях формирования цист темно-зеленая цитоплазма несколько отстоит от наружной клеточной стенки, их разделяет красно-коричневый слой. В зре лых цистах центральная часть выглядит темно-зеленой и отделяется неокрашенной нитяной от расположенной снаружи красно-коричневой экзины.
3.3.9. Капсулы и слои слизи Капсулы и слои слизи образуются некоторыми бактериями в специфических культуральных условиях. Лучше всего они видны во влажных препаратах, поскольку составляющие их сильно гидратированные коллоидные полимеры легко разрушаются и сокращаются в размерах при высушивании и фиксации. Самым простым и наиболее эффективным из трех методов окраски капсул, описанных ниже, является метод Дюгида. Метод окраски капсул по Дюгиду !. На чистое предметное стекло петлей наносят тушь и смешивают ее с культурой.
Покровное стекло помещают таким образом, чтобы была накрыта лишь часть смеси. 2. Сложенной много раз промокательной бумагой сильно прижимают покровное стекло к предметному стеклу до появления тонкого коричневатого слоя жидкости между ними. Препарат смотрят под большим увеличением, применяя безыммерсионные и иммерсионные объективы. Капсулы выглядят прозрачными зонами вокруг преломляющнх свет микроорганизмов на коричневато-черном фоне.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
