Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 9
Текст из файла (страница 9)
члсть ь мог«ология 2.1 ЖИВЫЕ КУЛЬТУРЫ Прн микроскопии препаратов живых культур используют очень полезный информативный метод типа «висячая капляь, Так называется препарат, когда капля с культурой свисает с покровного стекла в лунку, сделанную в толстой пластинке из прозрачной пластмассы (равд. 3.2.3). При атом бактерии находятся в ростовой среде, располагаясь в плоскости, прилежащей к покров- ному стеклу.
Поскольку обычно их берут из колонии в виде отдельных клеток, естественное взаиморасположение клеток не сохраняется, а из-за толщины подвешенного материала и возникающих оптических трудностей разрешение невелико. Несмотря на эти ограничения, данный метод можно использовать для прослеживания действия токсичных химических агентов и антибиотиков на рост клеток и их форму. Если необходимы длительные наблюдения в более оптимальных для микроскопии условиях, исследуют культуры, находящиеся на предметном стекле, а не препараты типа «висячая капля»; при этом их можно сделать достаточно тонкими и эффективно изучать, используя соответствующую оптику.
Лучше все~о применять фазово-контрастную микроскопию, но в большинстве случаев анализ можно проводить и с помощью обычной оптики. 2.1.1. Агаровая пластинка Для приготовления агаровых пластинок рекомендуется следующая методика. Чистые стерильные предметные стекла дважды (или большее число раз) погружают в расплавленный агар соответствующего состава, который находится в чашке Петри.
С нижней стороны стекол агар вытирают увлажненной тканью. Используя бинокулярную лупу, бактерии вносят в выбранную на верхней стороне стекла область с помощью вытянутого из пастеровской пипетки стеклянного волокна или стеклянной палочки. Кончик волокна смачивают в водном растворе пептона, слегка прикасаются им к колонии или культуре нужной бактерии, переносят приставшие к кончику бактерии в каплю водного раствора пептона на свежей поверхности агара и распределяют каплю по по- 46 а пРепАРАты для световой микРОскопии верхности. Обрезают агар вокруг выбранной области, кладут сверху покровное стекло и по его краям заливают воск. Если участок питательного агара меньше по- кровного стекла, то будет поступать воздух при минимальном высыхании, Соответствующие модификации и методические детали можно продумать и для анаэробов с целью получения информации о форме и размере их клеток, а также способе роста. 2.1.2.
Желатиио-агаровая пластинка Изменения в деталях внутреннего строения становятся видимыми при фазово-контрастной микроскопии, если использовать твердую питательную агаровую среду с большим коэффициентом преломления [11. Такую среду получают добавлением желатины до 14 — 18тэ [91. Высокие концентрации подходят для грамположительных бактерий, в то время как для грамотрицательных бактерий могут понадобиться более низкие концентрации. Вместо желатнны применяют также [111 поливинилпирролндон (до 30272). Этот методический прием позволил Мэйзону и Поуэлсону [31 проследить за процессом деления нуклеоидов в растущих бактериях и сделать фотографии на разных стадиях этого процесса. При необходимости культуры на пластинках можно фиксировать для окрашивания и даже подготовить для электронной микроскопии; однако образцы с таким мало погруженным в среду материалом [2, 71, находящимся в одной плоскости, требуют значительного мастерства в обращении и получении срезов.
Покровное стекло с приставшей к нему неповрежденной культурой и средой следует удалить с пластинки для фиксации и заливки в пластмассу. Легче всего удалить стекло с помощью полоски ленты Му!аг или какой-нибудь липкой этикетки. 2.2. ФИКСИРОВАННЫЕ ПРЕПАРАТЫ 2.2,1. Фиксация по Боуэну Препараты, в которых клетки по виду больше всего соответствуют живым, получают фиксацией 1п з11и; при описании формы клеток и способов нх роста наиболее полезны именно такие препараты, Их готовят следую- 47 ЧАСТЬ 1. МОРФОЛОГИЯ щим образом.
Бактерии выращивают на твердой среде в чашке Петри, внося в нее столько материала, чтобы через несколько клеточных делений образовался или сплошной монослой клеток, или еще не слившиеся микроколонни, в которых клетки не нагромождены друг на друга. В процессе роста состояние клеток контролируют с помощью микроскопа при низком увеличении (с десятикратным объективом). Если для приготовления препаратов клетки нужно брать из жидкой среды, то переносят соответствующее количество суспензии на пластинку с хорошо подсушенной агаровой средой и дают жидкости впитаться в слой агара. Кусочки агара вырезают из той области, где наблюдается правильное распределение клеток. Лучше всего вырезать квадратный слой агара со стороной около 1 см и перевернуть его стороной с микроорганизмами вниз на покровное стекло размером 22Х22 мм, не придавливая агар к стеклу и предотвращая скольжение.
В этом случае клетки прилежат к стеклу, сохраняя свое взаимное расположение. Покровное стекло с лежащим на нем слоем агара осторожно опускают в чашку Петри, содержащую достаточное для покрывания агарового слоя количество фиксатора Боуэна. Водоиасыщенная пикриновая кислота 75 мл Формалин 25 м Ледяная уксусная кислота 5 м Эти компоненты смепгинают и хранят в закупоренном пузырьке. Растворимость пикриновой кислоты — 1,4 г/100 мл при 20'С; в качестве исходного следует хранить водонасыщенный раствор и по мере надобности использовать его для приготовления фиксатора.
В одной чашке можно фиксировать несколько кусочков агара. Их оставляют на некоторое время в покое для полного проникновения фиксатора (минимум на 45 мин и максимум на 4 ч) н фиксации клеток на по- кровном стекле. Агар может отойти от стекла сам по себе или можно помочь ему отделиться, удерживая внизу покровное стекло пинцетом и приподнимая агар кончиком ножа резким движением; при этом следует избегать бокового смещения слоя вдоль стекла. Затем по- кровное стекло отмывают водой и кладут в 70о1е-ный этанол, где оно лежит до момента окрашивания. я пРвпАРАты для сВРтовои микРОскОпии Фиксированные по Боуэну препараты лучше всего окрашиваются разведенными растворами основных красителей. Подходят для этого 0,01%-ные растворы кристаллического фиолетового, тнонина или метиленового синего, которыми прокрашивают в течение 1 — 5 мин.
Точное время окрашнвання определяют в предварительных экспериментах. 1Аля окрашивания цнтоплазматических включений могут применяться другие красители (разд. 3.3.11). Основные красители прокрашивают богатую рибосомами цитоплазму преимущественно в хорон~о сохранившихся, фиксированных по Боуэну клетках; иуклеоплазма не окрашивается, она негативно выявляется точно так же, как и при фазово-контрастной микроскопии живых клеток.
Описанный способ фиксации не годится для окраски нуклеоплазмы по Гимзе, даже после обработки рибонуклеазой или кислотного гндролиза. Клеточные стенки не прокрашиваются (наиболее убедительно это продемонстрировано на образующих нити представителях рода Вас11(из), но их можно эффективно выявить обработкой фиксированных по Боуэну клеток 5з/а-ной (вес/объем, в воде) дубильной кислотой в течение 20 мин с последующей промывкой и окраской 0,01%-ным кристаллическим фиолетовым, достаточной по времени для интенсивного прокрашивания стенок. Предварительная обработка насыщенным раствором хлористой ртути в течение 5 мин также позволяет окрасить клеточную стенку основными красителями, такими, как кристаллический фиолетовый, тионип, виктория синяя [10).
Однако абсолютно надежного метода нет, причем наибольшие трудности возникают с грамотрицательпыми бактериями. Заключают препарат в воду илн разбавленный краситель (последний полезен, если интенсивность окрашнвання недостаточна для фотографирования), аккуратно промокают его, чтобы удалить избыток воды сверху и по краям покровного стекла, н заливают по краю покров- ного стекла воск, васпар или лак для ногтей. Из препарата можно удалить воду и сделать его постоянным, применив заливку смолой, но результат при этом не всегда удовлетворяет исследователя. Лучший способ сделать препарат вечным — сфотографировать его, а для этого описанный прием идеален. 4 — 1260 ЧАСТЬ Ь МОРФОЛОГИЯ Некоторые клетки не пристают хорошо к стеклу после фиксации через слой агара или применения метода пленочного прнлипапия (см.
ниже). Эту трудность можно частично преодолеть, если предварительно покрыть поверхность покровного стекла тонкой пленкой сывороточного или яичного альбумнна и дать ей высохнуть. Образу1ощаяся пленка может дать в готовом препарате слабоокрашенный фон, но в целом результат получается очень неплохой, Положительно заряженная пленка из полилнзина может оказаться еще более эффективной, чем две вышеупомянутые !41. 2.2.2. Фиксация парами Клетки, распределенные по поверхности агаровых слоев, независимо от того, были онн там выращены илн перенесены из другой среды, удобно фиксировать для световой микроскопии нарами четырехокнсн осмия нлн альдегидов, таких, как формальдегнд илн глутаральдегнд.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
