Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Важно соблюдать необходимые предосторожности, уделять внимание мелочам в работе н не забывать об источниках опасности, особенно работая с патогенными микроорганизмами. Помните, что даже фиксированные препараты организмов, содержащих эндоспоры, могут сохранить какой-то уровень жизнеспособности. К инструментам для взятия бактериальных проб относятся большая петля (диаметром 3 мм), маленькая петля (диаметром 1 мм) и прямая игла для внесения.
Онп бывают разных типов — платиновые, нихромовые и т. п. (иглы предпочтительно иметь нихромовые); длина их должна быть такой, чтобы после насадки на стек- 55 чхсть ь ИОРФологня лянную или алюминиевую ручку„ими можно было легко манипулировать при посеве в чашки, отборе материала колоний и внесении в пробирки со средами. 3.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ Для исследования живых бактернальных клеток разработан ряд методов.
При микроскопировании можно использовать культуры, выращенные в жидких средах, однако для получения нужного числа бактерий опи нуждаются, как правило, в разведении стерильной средой. Культуры, выращенные на твердых средах, можно суспендировать с помощью стерильной петли или иглы в капле стерильной жидкой среды или какого-нибудь раствора, но не водопроводной воды, до слабого помутнения (равд. 2.5.1).
Следует помнить, что возраст культуры и физико-химические параметры среды могут быть причиной ненаследуемых (феиотипических) модификаций как внепротоплазматическнх компонентов (жгутики и капсулы), так и компонентов, находящихся внутри собственно клетки (различные включения); все зги компоненты являются важными признаками, по которым ведется идентификация. Вместе с тем специальные операции или пересевы, производимые в лаборатории, могут благоприятствовать развитию мутантов, имеющих наследственно измененные по сравнению с диким типом черты строения. Изменения могут быть стабильными и нестабильными, но очевидно, что при описании формы и структуры бактерий условия содержания культуры должны быть строго определенными, так как старение культуры н изменения состава среды могут бгять причиной ряда морфологических изменений.
Специальные методы исследования растущих культур бактерий были описаны в гл. 2. Ниже мы приводим три метода, которые часто используются при исследовании живых клеток в целях идентификации. 3.2,1. Влажные препараты живых клеток Для приготовления влажных препаратов одну каплю пробы (около 0,05 — 0,1 мл) помещают на чистую обезжиренную (предварительным нагревом в течение 20 мин 66 3. методы идентиФикхции В светОвои микэоскопии при 400'С) поверхность предметного стекла (толщиной 0,8 — 1,0 мм) и накрывают ее покровным стеклом. Последнее имеет квадратную форму со стороной 22 мм, а толщина его составляет от 0,13 до 0,16 мм (номер 1 или 1'/з).
Чтобы предотвратить конвекционные токи, смещение или высыхание, зазор между покровным и предметным стеклами герметично заливают васпаром (смесь равных объемов петролатума и парафинового воска), петролатумом, свечным воском (используя фитиль свечи в качестве кисточки для нанесения расплавленного воска в пламени вспомогательной горелки, но не самой свечи) или прозрачного лака для ногтей. В течение короткого промежутка времени в этих препаратах можно наблюдать подвижность облигатных аэробных бактерий, однако, как только кислород истощится, бактерии прекращают движение. Если ввести в среду небольшие пузырьки воздуха, то их активность продлевается.
Для рассматривания влажных препаратов рекомендуется фазово-контрастная микроскопия, причем для получения наилучших результатов следует использовать как можно более тонкую водную пленку. Кусочек промокательной бумаги, положенный поверх покровного стекла до герметизации, способствует выводу излишнего количества жидкости (так что в препарате остается лишь необходимая для просмотра тонкая пленка) и подсушнванию поверхности потенциальных полей зрения.
Тепло от источника света может нарушить оптимальные движения бактерий. Если наблюдения ведутся в течение длительного периода времени, рекомендуется вставлять тепловой фильтр. Поскольку белый свет может вызывать нарушение подвижности, применяют зеленый светофильтр, лучше других реалнзуюШнй коррекции, даваемые линзами, и хорошо воспринимаемый глазом наблюдателя.
Нагревание пробы предотвращают также с помощью задерживающей оптической вставки, заполненной 5-сантиметровым слоем раствора Мора 150 г сульфата железа и аммония, 1,3 мл 33%-ной (объем/объем) серной кислоты и 250 мл дистиллированной воды) . ЧАСТЬ 1 МОРФОЛОГИЯ 3.2.2. Метод висячей капли Этот метод заключается в следующем. Каплю пробы помещают в центре чистого покровного стекла, которое затем переворачивают и устанавливают над углублением в специальном предметном стекле так, чтобы капля висела па покровном стекле. Капля должна быть достаточно маленькой, чтобы она не касалась дна углублении. Для герметизации и фиксирования стекла на месте рекомендуется капнуть маленькую каплю воды на край по- кровного стекла. Препараты типа «висячая капля» имеют некоторые недостатки, связанные с вогнутостью углубления предметного стекла, кривизной капли и увеличенной толщиной предметного стекла, которая порождает оптические аберрации.
Различная глубина фокусировки, требуемая для просмотра пробы от края к центру, затрудняет наведение фокуса на отдельную клетку, особенно если она подвижна; лучше всего фокусировка удается на краю капли. Некоторых трудностей избегают, если используют предметные стекла с лунками, имеющими плоское дно. Тогда их можно заполнить образцом и накрыть покровным стеклом, как описано выше, 3.2.3.
Метод висячего агарового слоя Для приготовления препаратов живых клеток типа «висячая капля» существует хорошее приспособление— пластина из прозрачной пластмассы с высверленным в центре отверстием, имеющим диаметр около 1 см. По- кровное стекло с висящей на нем каплей помещают над отверстием, а для того, чтобы стекло удерживалось на месте, на его край наносят каплю иммерсионного масла или воды. Подобным образом к стеклу можно прикрепить тонкий слой агара с растущей культурой или островками колоний, размазанных по стерильной находящейся рядом с ними поверхности.
Образуемую отверстием камеру можно закрыть, прикрепив снизу покровное стекло. з. мвтоды идвнтиьиклции в сввтовоп микгоскопии 3.2.4. Негативное окрашивание Этот внд окрашивания дает возможность самыми простыми, а зачастую и самыми быстрыми способами получить информацию о преломляющих свет включениях, таких, как сера или гранулы поли р-оксимасляной кислоты, и о спорах 1121. При его осуществлении взятый петлей 7'го-ный (вес/объем) водный нигрозин (или тушь, или конго красный) тщательно перемешивают с бактериальной суспензией на покровном стекле, размазывают смесь до образования тонкой пленки и высушивают на воздухе. Затем кладут покровное стекло на предметное пленкой вниз и фиксируют его положение одной-двумя каплями свечного воска.
В приготовленных подобным образом препаратах, содержащих вместо заливки воздушный слой, бактерии не прокрашиваются и выделяются на темно-синем фоне ярким свечением. В дальнейшем они даже могут быть использованы в работах по изучению характера и степени разрушения клеток (гл. 5). Негативно окрашенные препараты не следует применять для измерения длины и ширины клеток (см. ниже), так как вокруг клеточной стенки может находиться капсула или слой слизи. Более того, отрицательно заряженные частицы коллоидного нигрозина не реагируют с клеточной поверхностью, поскольку при физиологических значениях рН последняя также заряжена отрицательно.
При высыхании коллоидной пленки благодаря одинаковому заряду коллоидных частиц и бактерий черный край высыхающей пленки находится на относительно значительном, хотя и маленьком абсолютно расстоянии от истинной границы клетки. В результате видимый размер бактерии оказывается больше, чем действительный, даже сели нет капсульг. В растворах нигрозина могут завестись посторонние микроорганизмы; предотвратить это помогает небольшая добавка формальдегида, не ухудшающая свойств раствора. 3.2.5.
Простое окрашивание Морфологические исследования бактерий, как правило, проводятся на фиксированных н окрашенных препаратах. При использовании только одной краски процесс 59 часть ь мОРФОлОГия называют простым окрашиванием. Исследуемую пробу распределяют по предметному стеклу на площади 1 см'. Для этого достаточно одной петли культуры, выращенной в жидкой среде, или одной капли стерильной дистиллированной воды, в которой суспендировано небольшое количество культуры, взятой с твердой среды с помощью иглы или петли. (Бульонные культуры не всегда подходят из-за образующегося при фиксации белкового преципитата; поэтому во многих случаях можно улучшить качество препарата фиксацией в формалине с последующими центрифугировапием и отмывкой.) Когда препарат высыхает, производят тепловую фиксацию (фламбирование), проводя несколько раз предметное стекло материалом вверх над пламенем горелки Бунзена, чтобы убить выжившие организмы и обеспечить прикрепление бактериальной пленки к стеклу.
Высушивание и нагревание вызывают сжатие и деформацию бактерий и могут нарушить структуру связей между клетками; не забывайте об этом при интерпретации морфологических данных. Более четко, хотя и с ббльшими затратами времени, фиксацию осуществляют с помощью химических агентов. Проста и часто вполне удовлетворительна фиксация 5%-ным формалином (объем/объем) в течение нескольких минут, особенно для окраски по Граму (равд. 3.3.5). Подробное описание фиксации четырехокисью осмия (разд. 2.2.2) и по Боуэну (равд. 2.2.1) см. в гл. 2.
В последнем случае берут бактерии, выросшие за несколько часов в микроколонии или распределенные до монослоя на твердой среде в чашке Петри. Кусочек агара с бактериями вырезают, фиксируют и переносят на покровное стекло, а затем окрашивают соответствующим образом одним из основных красителей или специально обрабатывают для получения цитохимической информации. Эту методику применяют к молодым культурам всего через несколько часов после посева на агар, когда формируется сплошной слой из микроколоний. Лучше всего заливать агар соответствующей суспензией и отсасывать избыток пастеровской пипеткой„ наклоняя чашку. После этого чашку подсушивают и инкубируют.
Влажные пленки бактерий на покровных стеклах фиксируют и до высушивания, выдерживая их в парах 27Я-но- а. метОды идентиФикАции В сВетОВОЙ микРОскОпии 2 г 20 мл 80 мл 81 го (вес/объем) водного ОВО4 в течение 2 — 3 мип. Но намного лучше фиксировать клетки, подготавливая их к окраске, после того как клеточная суспензия была распределена по поверхности стерильного агара и жидкость впиталась в агар. В описанных выше методах бактерии находятся на покровном стекле, а предметное стекло служит основанием. С цитологической точки зрения лучше, если фиксированные химическим путем и слегка окрашенные бактерии при монтировании препарата будут в воде и если их высь1хание предотвращено на всех этапах обработки. Препараты, фиксированные ОВО„не прокрашиваются достаточно хорошо прн простом окрашивании, если они не прошли вторую фиксацию, например фиксатором Шауднна (б,б мл насыщенной НКС!„33,3 мл абсолютного этанола и 2о/о-ная (объем/объем) ледяная уксусная кислота, добавленная перед использованием; 6,9 г НКС!з в 100 мл воды при 20 С дает насыщенный раствор].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
