Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Метод окраски капсул по Гиссу 1. Взятую петлей бактернальную суспензию смешивают с каплей нормальной лошадиной сьворотки илн снятого молока на предметном стекле. 2. Высушивают пленку на воздухе и мягко фиксиру. ют ее нагреванием. 3. Покрывают пленку красящим реактивом кристаллического фиолетового (кристаллический фиолетовый а, метОды идентиФикапии В сВетОВОЙ микРоскОпии 0,1 г, дистиллированная вода 100 мл) и нагревают до появления пара. 4. Отмывают кристаллический фиолетовый 20о/о-ным (вес/объем) водным раствором сульфата меди (СВАО, 5Н,О). Подсушивают впитывающим воду материалом н смотрят в микроскоп, Капсулы выглядят бледно-голубыми, а сами микро организмы — темно-фиолетовыми. Метод окраски капсул по Антони 1. Высушенную на воздухе пленку окрашивают В течение 2 мин 1о/о-ным (вес/объем) водным раствором кристаллического фиолетового, 2.
Краситель отмывают 20%-ным (вес/обьем) водным раствором сульфата меди (СпЬО, 5Н,О), удаляют избыток последнего и подсушивают впитывающим влагу материалом. Капсулы выглядят светло-голубыми, а микроорганизмы — темно-фиолетовыми. 3.3.10. Жгутики Хотя Кох разработал способ окраски жгутиков более чем столетие назад, существующие в настоящее время соответствующие методики не отличаются легкостью и надежностью. Поскольку толщина бактериальных жгутиков лежит за пределами разрешения светового микроскопа (жгутики имеют диаметр около 10 — 30 нм), для того чтобы нх увидеть, необходимо, так сказать, «вымазать нх дегтем и обвалять в перьях». Неподвижные бактерии лишены жгутиков, однако известны организмы, жгутики которых «паралнзованы» (/(а"то(-). Метод окраски жгутиков по Грэю Раствор Ае Дубильная кнслота [20е/з-ная (вес/объем) водная) 2 мл Калийные квасцы (КА1(30з)т 12НзО), насыщенные б мл водные) Хлористая ртуть, насыщенный водный раствор 2 мл Основной фуксин Зев-ный (вес/объем) в рб'/,-ном 0,4 мл (объем/объем) зтаноле Краситель желательно добавлять к остальным пнгреднентам непосредственно перед использованием н конечный раствор отфнльтровывать.
77 часть ь морФология Раствор В: Кврболфуисин, приготовленный по Цилю (рвзд. З.з.б) Методика: 1. Обычные бактерии удобно выращивать на косячках агара с соответствующим содержанием питательных веществ. За 0,5 ч до взятия пробы в пробирку с косячком добавляют водный раствор пептона, в который переходят микроорганизмы, так как жидкая среда является наиболее подходящей в подобных экспериментах. Затем пробу цснтрнфугируют, чтобы освободиться от составных элементов среды, промывают и вновь цептрифугируют.
Осадок осторожно (чтобы предотвратить потерю жгутиков) ресуспендируют в 107о-ном (объем/объем) водном формалине до получения слегка мутной суспензии. 2. Суспензию петлей наносят на предметное стекло, наклоняют его под углом 45' и подсушивают препарат на воздухе. 3. Фильтруют прямо на пленку раствор А и оставляют его па ней приблизительно на 6 мин.
Точное время следует определить экспериментально. 4. Раствор А смывают с предметного стекла дистиллированной водой. 5. На пленку кладут кусочек промокательной бумаги и заливают иа 3 мин раствором В. 6. Удаляют промокательную бумагу, промывают предметное стекло дистиллированной водой, осторожно подсушивают впитывающим влагу материалом и смотрят в микроскоп. Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в красный цвет. Значительная доля успеха в осуществлении метода зависит от использования абсолютно чистых обезжиренных предметных стекол. Чтобы обеспечить чистоту стекол, их нагревают либо в пламени горелки Бунзена, до тех пор пока пламя по краям стекла не становится желтым (после чего стеклам дают остыть), либо в муфельной печи в течение 20 мин прн 400'С (предметные стекла в печи располагают так, чтобы они не соприкасались).
После охлаждения стекла используют немедленно или хранят в емкости, не содержащей пыли. Стекла также становятся очень чистыми, если их сначала протереть жидким очистителем Воп Ат!, а затем 78 3, МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ В СВЕТОВОИ МИКРОСКОПИИ бумажной тканью К1еепех. Не рекомендуется применять для очистки стекол, на которых красят жгутики, такие очишаюшне агенты, как хРомоваЯ кислота или 50ого-ный (объем/объем) спирт.
Метод окраски жгутиков по Ляйфсону Раствор 1: Хлористый натрий ',5 г Дистиллированная вода 1О мл Раствор 2 Дубильная кислота 3,0 ~ Дистиллированная вода 100 мл Раствор 8: Уксуснокислый а-розанилин 0,9 Солянокислый л-розанилип 0,3 Этанол 95тюный (объем/объем) 100 мл Смешивают равные объемы растворов 1 и 2; затем два объема получившейся смеси приливают к одному объему раствора 3. В охлажденном виде полученная спесь храаится 1 — 2 мес.
Методика: 1. Высушенный на воздухе образец готовят в соответствии с 1-м и 2-м этапами метода Грэя. 2. Восковым стеклографом очерчивают вокруг бактериальной пленки прямоугольник. 3. Наносят на предметное стекло 1 мл раствора красителя, так чтобы нисколько не вытекло за пределы восковой линии. Оставляют краситель приблизительно на 7 — 15 мин; оптимальное время реакции следует определить экспериментально. 4.
Как только на поверхности красителя образуется золотистая пленка и при освещении снизу будет видно, что вся пленка сплошь покрыта осадком, краситель удаляют, заставляя «плыть» эту пленку по поверхности пущенной из-под крана струи воды. Пленку высушивают на воздухе и смотрят в микроскоп. Тела и жгутики бактерий окрашиваются в красный цвет. 3.3.11. Цитоплазматические включения У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включе- 79 ЧАСТЫ. МОРФОЛОГИЯ пнями. Среди них — отложения жира, поли р-оксимасляной кислоты, полифосфата, крахмалоподобных полисахаридов, серы и различных кристаллов.
Некоторые из них представляют собой полимеризованные ненужные продукты, а другие можно отнести к запасам питательных веществ. Для выявления этих включений, которые к тому же преломляют свет, применяется несколько методик окраски. Окрашивание поли-0-оксимасляной кислоты Для выявления цитоплазматических включений в бактериях используют следующий метод: 1.
Фиксированную нагреванием бактериальную пленку образца на предметном стекле погружают в раствор 0,3%-ного (вес/объем) судана черного В, приготовленного на этиленгликоле. Фильтруют и окрашивают в течение 5 — 15 мин (время определяют экспериментально). 2. Краситель сливают и препарат высушивают на воздухе, положив предметное стекло на промокательную бумагу. 3. Несколько раз погружают и промывают предметное стекло в ксилоле, а затем подсушивают впитывающим ксилол материалом.
4, Дополнительно окрашивают препарат в течение 5 — 10 с 0,5%-ным (вес/объем) водным сафранином, 5. Промывают предметное стекло водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп. Включения поли+оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие капельки, в то времГ как цитоплазма окрашивается в розовый цвет. Опрашивание полифосфата Включения, состоящие из неразветвленных структур с элементным составом М„+~Р„Оз, ь выявляют следующим образом.
1. Бактериальную пленку образца на предметном стекле фиксируют нагреванием. 2. Окрашивают пленку в течение 10 — 30 с в растворе метиленового синего по Лефлеру или в 1%-ном (вес/объем) толуиднновом синем. 3. Отмывают краситель водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп. 80 з. мвтоды идентификации в святовоп микгоскопни При окраске метиленовым синим гранулы полифосфата выглядят шариками, имеющими цвет от синего до фиолетового, а вся остальная цитоплазма окрашивается в светло-голубой цвет. Толуидиновый синий окрашивает метахроматически, и гранулы имеют красный цвет на фоне голубой цитоплазмы. Окрашивание полнсахарндов с использованием реактива Шиффа Этим методом выявляют гликогеноподобные вещества. 1.
Пленку суспензии на предметном стекле фиксируют нагреванием, 2. На 5 мин на стекло наносят раствор периодата 120 мл 4'/,-ной (вес/объем) иодной кислоты в воде, 10 мл 0,2 М водного ацетата натрия и 70 мл 95ч/ч-ного этанола; защищать раствор от светаЦ. 3. Отмывают стекло 70%-ным (объем/объем) этанолом. 4. На 5 мин наносят на предметное стекло восстанавливающий раствор, содержащий 300 мл этанола, 5 мл 2 н.
соляной кислоты, 10 г иодистого калия, 5 г тиосульфата натрия (пятиводного), 200 мл дистиллированной воды. Восстанавливающий раствор готовят следующим образом: к раствору иодистого калия и тиосульфата натрия в дистиллированной воде сначала приливают этанол, а затем соляную кислоту. Смесь перемешивают и оставляют на некоторое время для выпадения в осадок серы, после чего собирают надосадочную жидкость. 5. Отмывают стекло 70ч/ч-ным (вес/объем) этанолом. 6. Окрашивают препарат реактивом Шиффа в течение 15 — 45 мин (точное время следует определить экспериментально).
Реактив Шиффа готовят следующим образом; 2 г основного фуксина растворяют в 400 мл кипящей дистиллированной воды, охлаждают до 50'С и фильтруют через фильтровальную бумагу. Добавляют к фильтрату 1О мл 2 н. соляной кислоты и 4 г метабисульфита калия. Сосуд плотно закупоривают и оставляют на 12 ч в холодном темном месте. Добавляют такое количество 2 н. соляной кислоты (-1О мл), чтобы при высы- члсть ь мОРФОлОГия ханин на предметном стекле реактив не давал розового налета. Реактив Шиффа хранят в темноте. 7. Несколько раз отмывают стекло раствором, состоящим из 2 г метабисульфита калия и 5 мл концентрированной соляной кислоты, в 500 мл дистиллированной воды.
8. Отмывают препарат водопроводной водой и дополнительно окрашивают 0,002%-ным (вес/объем) водным раствором малахитового зеленого в течение 2 — 5 с. 9, Отмывают препарат водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп. Полисахариды окрашиваются в красный цвет, все остальные компоненты цитоплазмы — в зеленый. Метод окраски полисахаридов алциановым синим Для выявления полисахаридов можно также использовать алцнановый синий. Обычно применяют 1 %-ный (вес/объем) раствор алцнанового синего в 95%-ном (объем/объем) этаноле, а в качестве дополнительного красителя используют карболфуксин.
Последовательность операций такова: 1. Пленку препарата на предметном стекле фиксируют нагреванием. 2. Окрашивают пленку в течение 1 мин разведенным в 9 раз (в воде) алциановым синим, приготовленным, как описано выше. 3. Отмывают препарат водопроводной водой и высушивают. 4. Дополнительно очень быстро окрашивают (не следует допускать перекрашивания!) препарат карболфуксипом (равд.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
