Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 16
Текст из файла (страница 16)
3,3.6) и сразу же отмывают водопроводной водой. Высушивают пленку на воздухе и смотрят в микроскоп. Полисахариды окрашиваются в голубой цвет, а другие составляющие цитоплазму компоненты — в красный. 3.4. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ В этот раздел включен ряд методов, которые не являются столь обычными, чтобы их применять при первом ознакомлении с пробами. а. методы идвнтиФикдции в сввтовои микроскопии 3.4.1. Спирохеты 1 г бг 100 мл 83 Спирохеты не прокрашиваются удовлетворительно «обычными» красителями, хотя свободноживущие спирохеты хорошо видны в нигрозиновых пленках. Размеры (толщина) многих из них находятся на пределе разрешения светового микроскопа.
Обычно эти бактерии наблюдают живыми с помощью прямой темнопольной нлн фазово-контрастной микроскопии. Полезно знать, что в пленках, окрашенных по Гимзе, спирохеты флуоресцируют ярким золотисто-желтым светом при просмотре с темнопольным освещением. Хорошие результаты обычно получают при использовании метода Фонтаны. Метод окрашнвания спирохет по Фонтане Раствор А (фиксатор): Уксусная кислота 1 мл Формалин 2 мл Дистиллированная вода 100 мл Раствор Н (лротрааа): Фенол Дубильная кислота Дистиллированная вода Раствор С: К О,бай-ному (вес/объем) водному раствору нитрата серебра приливают 10'!,-ный (вес/объем) раствор водной гидроокиси аммония (по каплям) до тех пор, пока образовавшийся нначале осадок только-только начннаст растворяться.
Раствор дс Этанол абсолютный Методика: 1. Высушивают на воздухе пленку на предметных стеклах, очищенных тем способом, который применяют прн окрашивании жгутиков. 2. Фиксируют пленку в растворе Л в течение 1— 2 мнн. 3. Отмывают пленку в растворе О в течение 3 мин. 4. Наносят на пленку раствор В и нагревают в течение 30 с, пока не начинает подниматься пар. 5. Отмывают пленку дистиллированной водой и высушивают препарат. б. Наносят на пленку раствор С и нагревают, пока ЧАСТЫ.
МОРФОЛОГИЯ не начинает подниматься пар, а сама пленка не становится коричневой, Пленку отмывают, высушивают н смотрят в микроскоп. Спирохеты выглядят коричневато-черными. 3.4.2. Мнкоплазмы Микоплазмы, вероятно, представляют собой самые маленькие бактерии, которые можно наблюдать в световой микроскоп и которые с трудом поддаются индивидуальному распознаванию из-за сильно выраженного плеоморфизма. Характерные колонии микоплазм, имеющие вид яичницы-глазуньи, наблюдают при прямой микроскопии чашек с агаром. Для анализа колоний полезен подход, разработанный Динесом и заключающийся в том, что препараты смотрят после того, как на место роста бактерий наносят каплю метиленового синего и накрывают ее покровным стеклом. В случае объектов, близких по размерам к пределам разрешения, оптиче. ские измерения при фазово-контрастной микроскопии затруднены по двум причинам.
Первая — это ореольные артефакты и вторая — присущие фазовому контрасту особенности формирования изображения, благодаря которым круглые объекты выглядят меньше, чем они есть на самом деле. В морфологических исследованиях и при изучении подвижности микоплазм применяются влаж. ные препараты. Что же касается типа микроскопировання, то рекомендуются методы фазового контраста н темнопольного освещения. Если нужны окрашенные препараты мнкоплазм, то предпочтительнее использовать несколько модифицированную методику окраски по Гкмзе (см.
ниже), которую следует применять к предварительно фиксированным организмам. Фиксировать мико- плазмы лучше раствором Боуэна (равд. 2.2.1) непосредственно в слое агара„лежащем на покровном стекле. 3.4.3. Риккетсии Риккетсии являются облигатными внутриклеточными паразитами (за исключением йкйе(!зГа йшпШЛО), которые, как правило, имеют палочковидную форму, встречаются парами н обладают выраженным плеоморфиз- 84 3.
МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ В СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ мом. Их можно видеть в пленках инфицированной ткани при прямом микроскопическом анализе, если окрасить препараты по Гимзе или по Гименецу. Большинство рнккетсий при атом имеют внд фиолетовых коккобациллярных микроорганизмов с различной длиной — от 0,25 до 2 мкм. Чаще всего наблюдаются пары и короткие цепи. Самая маленькая риккетсия — Сохрейа Ьигпем! (размер — 0,25Х! мкм) — выглядит, как окрашенная с двух полюсов палочка, находящаяся в цитоплазме инфицированных клеток.
Риккетсии тифа и пятнистой лихорадки в целом крупнее (ширина — 3 — 0,6 мкм, длина— 1,2 мкм). Риккетсии пятнистой лихорадки обнаружены как в ядрах, так и в цитоплазме инфицированных клеток и часто окружены ореолом, иногда ошибочно принимаемым за капсулу. Инфицированные ткани можно прямо анализировать в флуоресцентном микроскопе, используя специфические антисыворотки, меченные изотиоцианатом флуоресцеина. При окраске по Граму риккетсии красятся как грамотрицательные. Метод окраски рнккетсий по Гнмзе Исходный концентрированный раствор: Порошок красителя Гимзы 0,5 г Глицерин ЗЗ мл Абсолютный метанол (свободный от ацетона) 33 мл Порошок красителя Гимзы растворяют в глицерине при 55— 60чС в течение 1,5 — 2 ч.
Добавляют метанол, тщательно перемешивают и оставляют стоять на неноторое время. Хранит реактив, в котором нет осадка, при номнатной температуре. Для использования одну часть исходного концентрированного раствора разводят в 40 — 50 раз нейтральной дистиллированной водой или забуференной водой, рН 6,8, Методика: 1. Образец на предметном стекле высушивают на воздухе, фиксируют 5 мин в абсолютном метаноле и вновь высушивают на воздухе.
2. Наносят на образец свежеприготовлснный раствор Гимзы на ! ч. 3. Отмывают 95%-ным (объем/объем) зтанолом для удаления избытка красителя, высушивают на воздухе и 85 чАсть !. мореологи» смотрят в микроскоп с целью выявления базофильно окрашенных организмов, находящихся внутри цнтоплазмы. Метод окраски риккетсий по Гименецу Исходный концентрированный раствор: Основной фуксин !О г Этанол 95ей-ный (объем/объем) !00 мл Фенол 4е)ееный (весробъем), водный 250 мл Дистиллированная вода 650 мл Сначала краситель растворяют в этаноле, а затем добавляют другие ингредиенты. Г!еред использованием красящий раствор вы. держивают в течение 4В ч при 37 'С.
При использовании красителя исходный концентрированный раствор разводят в отношении 1: 2,5 фосфатным буфером, рН 7,45, приготовленным смешиванием 3,5 мл 0,2 М )ч)азНР0„15,5 мл 0,2 М ХазНРО, и 19 мл дистиллированной воды. Затем краситель фильтруют.
Он может храниться 3 — 4 дня, но каждый раз перед использованием должен фильтроваться. При окраске этим методом требуется также 0,8%-ный (вес/объем) водный раствор щавелевокислого малахитового зеленого. Методика: 1. Образец фиксируют нагреванием и наносят на него на 1 — 2 мин красящий раствор. 2. Отмывают водопроводной водой и окрашивают в течение 5 — 10 с малахитовым зеленым. 3.
Вновь отмывают образец водопроводной водой и второй раз окрашивают малахитовым зеленым. 4. Тщательно отмывают предметное стекло водопроводной водой, подсушивают промокательной бумагой и смотрят в микроскоп. Риккетсии выглядят как окрашенные в красноватый цвет бактерии на зеленом фоне. 3.4.4.
Водные бактерии При прямом микроскопировании проб морской воды, как правило, выявляется лишь немного бактерий. Для концентрирования микроорганизмов с целью определения их общего числа в единице объема, а также с целью выявления различных морфологических типов приме- 3. Методы ндентиФикхции в сввтовои микгоскопин няется фильтрация. Один из способов фильтрации [7! заключается в следующем. Фильтры из поликарбоната диаметром 25 мм (с диаметром пор 0,2 мкм) предварительно окрашивают в течение 5 мнн в 0,2%-ном (вес/объем) растворе иргаленового черного (цветовой индекс среди кислых черных красителей № 107, !.!п!оп СагЬ!бе Согр., Ыечг УогК Ы.
У) в 2%-ной (объем/объем) уксусной кислоте, отмывают дистиллированной водой и помещают в увлажненном виде в стеклянный аппарат для фильтрования (М!!1!роге Согр., Веб(огб, Маза.). Заготовленные фильтры, высушенные после предварительной окраски н промывки, перед использованием увлажняют дистиллированной водой, лишенной бактериальных клеток, на специальном держателе для фильтра. Пробу морской воды, фиксированную нейтрализованным (с помощью ВаСОз) глутаральдегидом [доведенным до концентрации 0,!з/з (объем/объем)), выливают в воронку над фильтром. Затем к пробе добавляют 0,1%-ный (вес/объем) раствор акридинового оранжевого (с 40з/з-ным содержанием красителя в исходном реактиве) в 0,02 М трнсе, рН 7,2 (при 20'С) с таким расчетом, чтобы конечная концентрация красителя составила 0,01% (вес/объем).
После прокрашивания в течение 3 мин проба с акриднновым оранжевым просасывается (под действием приложенного отрицательного давления 125 мм рт. ст.) через мембранный фильтр. Затем фильтр вынимают из аппарата и кладут на каплю иммерсионного масла (типа 1, Р или А; Сагйч1- !е (.аЬога!ог!ез, 1пс., Себаг Огоче, Ы.,).), находящуюся на предметном стекле. Другую каплю наносят сверху и накрывают покровным стеклом. Эти операции следует проводить быстро, чтобы фильтр на высох. Препарат просматривают в стандартном микроскопе, оснащенном системой возбуждения люминесценции падающим светом, включающей в себя 100-ваттную галогеновую лампу, возбуждающий светофильтр В6-12, запирающий светофильтр 1.Р-510 и светоделитель РТ-510.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
