Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Капли удобно наносить на пластинку зубного воска, ополоснутого дистиллированной или деионизованной водой для удаления пыли и растворимых солей. 10! ЧАСТЬ Ь МОРФОЛОГИЯ Иногда смеси красителя и суспензии распыляют иа сетки, но для этого нужен специальный аппарат; этот метод наиболее полезен для количественной оценки вирусов и других маленьких частиц 1261. При изучении бактерий особенно полезен способ нанесения сеток, покрытых пленкой, на бактериальный газон или колонии. Сразу же после снятия сеток удаляют лишнюю жидкость и проводят окрашивание. Этим способом можно исследовать природное состояние бактерий и их пространственные взаимосвязи, не нарушенные набиранием в пипетку или другими процедурами, для которых характерны сдвиговые усилия.
Подобные процедуры могут вызвать отрыв жгутиков, ворсинок или других хрупких структур. Описанный способ полезен также для быстрого определения морфологического типа фага, вызвавшего образование стерильного пятна на газоне индикаторной культуры бактерий. Отмывка Отмывка сетки — полезная дополнительная процедура, следующая за нанесением суспензии, но предшествующая негативному контрастированию (в двухэтапном методе).
Ее проводят для того, чтобы удалить остатки клеток, а также излишки солей н белка, выпадающие в осадок под действием некоторых красителей н ухудшающие изображение исследуемых компонентов. Отмывку проводят, быстро прикасаясь поверхностью сетки к капле воды, причем эту операцию повторяют несколько раз с новыми каплями дистиллированной воды или еще какой-либо жидкости. Другой способ отмывки заключается в том, что сетку препаратом вниз помещают на влажную поверхность полоски тонкой согнутой фильтровальной бумаги ватман № 1, которая через край впитывает отмывающую жидкость нз маленького стаканчика или чашки Петри.
В любом из этих случаев сетку Окрашивают сразу же после удаления избытка жидкости фнльтровальной бумагой. Помимо воды, для отмывки могут быть испробованы различные растворы; при их выборе следует учитывать свойства исследуемых частиц, а также то, что соли и другие вещества, мешающие окрашиванию, должны 102 4. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ быть обязательно удалены. Во многих случаях для отмывки лучше всего применять 17э-ный водный ацетат аммония, поскольку он не реагирует с бактериями, микоплазмами, мембранами, вирусами и большинством внутриклеточных компонентов, а также потому, что его избыток улетучивается в условиях вакуума электронного микроскопа. При первом знакомстве с микроорганизмами из жидких культур в болыпинстве случаев образующийся после центрифугирования осадок суспендируют в небольшом количестве ацетата аммония и суспензню наносят на сетку. Центрифугнрование бактерий в любых целях, в том числе на этапе фиксации н отмывки препаратов, готовящихся методом заливки (разд.
4.1.2), удобнее и быстрее всего проводить в настольных центрифугах, таких, как центрифуги фирм ВПпйгпапп или Еррепйог1. Объем конической пластмассовой пробирки в них не должен превышать 1,5 мл.) Красители В качестве красителей для негативного окрашивання используются различные соли тяжелых металлов. Наш опыт свидетельствует о том, что самой подходящей солью является молибдат аммония, так как он хорошо распределяется, не реагирует с белками и большинством других компонентов суспензни и его концентрацию легко регулировать для создания требуемой степени контраста 1321.
Пожалуй, чаще других используются растворы фосфорновольфрамового натрия и калия, в целом удовлетворительные при нейтральных значениях рН. Широко применяются соли урана, поскольку их молекулы, обладающие небольшимн размерами, хорошо проникают в поверхностные неровности н тем самым улучшают разрешение тонких деталей. Ураннлацетат, который, как правило, имеется в электронно-микроскопических лабораториях, потому что его используют также при окрашивании срезов, дает хорошие результаты при концентрации -1% или меньше. Но его растворы имеют очень низкий рН (около 2,5), и, даже будучи частично нейтрализованным непосредственно перед использованием, он начинает выпадать в осадок при рН выше 4,5.
Некоторые структуры ура- 103 часть ь могэология нилацетат окрашивает позитивно, н на одной и той же сетке могут быть видны участки как позитивно, так и негативно окрашенные. Ко всему прочему, он действует как фиксатор на белки н пукленновые кислоты, вызывает сжатие и округление ограниченных мембранами клеток (например, мнкоплазм), разрушает некоторые белковые структуры прн рН 4,5 н должен применяться только для чистых и хорошо отмытых препаратов. В связи с этим особую ценность приобретает уранилоксалат, так как его можно использовать при нейтральных значениях рН.
Иногда также используют ураннлформиат, кремневольфрамовокнслый натрий н другие соли. Соли урана обладают незначительной радиоактивностью и токсичностью, поэтому во время работы с ними необходимо быть осмотрительными. Некоторые исследователи советуют добавлять к ряду красителей (например, к фосфорновольфрамату, но не к солям урана) с целью улучшения их распределения незначительные количества удерживающих воду агентов, таких, как сывороточный альбумин, крахмал нлн сахароза 122~. Не все находят это полезным или необходимым, особенно в тех случаях, когда требуются большие увеличения или хороший фон.
Фиксация Иногда перед негативным контрастнрованнем оказывается полезной химическая фиксация микроорганизмов. Ее применяют для того, чтобы избежать структурных изменений и искажений нз-за действия растворов с разными рН н осмотическнми свойствами, из-за действия самих красителей илн нз-за высушнвання в красителе. Фиксацию проводят в растворах глутаральдегнда низкой концентрации, а иногда суспензню на сетке подвергают действию паров глутаральдегида в закрытом сосуде. Перед окраской фиксированные бактерия нуждаются в отмывке либо прямым способом, либо путем отмывки сеток методами, упомянутыми выше. В итоге часто наблюдается в какой-то степени позитивное окрашиванне, а задержка красителя вокруг фиксированного микроорганизма такова, что для окрашнвания можно применять значительно менее концентрированные растворы красителя. 104 С ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ «Подводные камни», трус)ности, предосторожности Много указаний на трудности, встречающиеся в электронной микроскопии, уже было сделано в предшествующих разделах.
Когда говорят о доступности электронного микроскопа, подразумевают наличие по крайней мере одного опытного оператора, хорошо знакомого с обслуживанием и эксплуатацией напылительных установок, ультрамикротомов н самого микроскопа. При наблюдении негативно контрастированных образцов особенно важно добиться нужной степени контраста н разрешения, применяя соотвстствуюгцее ускоряюгцее напряжение (обычно 60 — 80 кВ).
Заостренные катодные нити электронной пушки желательны, но не обязательны. Загрязнение колонны микроскопа, апертур и образца сводится к минимуму, если заботиться о надлежащем использовании охлаждаемого жидким азотом противозагрязнительиого устройства и самоочишаюшихся золотых апертур объектива. Чтобы устранить дрейф образца, нужно терпеливо провести предварительные эксперименты с электронными пучками разной интенсивности н использовать углеродно-пластмассовые или чисто углеродные пленки-подложки. Повреждение или изменение тонкой структуры под действием пучка электронов, а также образование пятен красителя вокруг образца и на самом образце можно свести к минимуму, если научиться быстро наводить фокус при наименьшей допустимой интенсивности пучка. Для фотографирования при этом следует использовать как можно более короткие выдержки, которые, если учесть применяемую систему проявления фотопленки, соответствуют достижению желаемого контраста.
Наилучшие результаты обычно получают с короткими выдержками при относительно низком увеличении; каждый микроскопист методом проб и ошибок определяет для используемого им микроскопа и изучаемого объекта те увеличения, прн которых легче всего производится фокусирование и получаются наиболее четкие результатьь В красителях и в отмывающих растворах (ацетат аммония) илн даже в деионизованной и дистиллированной воде при долгом хранении иногда появляются бактерии. Если есть подозрение на присутствие в растворах Щ ЧАСТЫ.
МОРФОЛОГИЯ бактерий, их проверяют в электронном микроскопе. Рабочие растворы красителей (обычно 2%-ные растворы молибдата аммония, фосфорно-вольфрамового калии и ураннлацетата) хранят в небольших пузырьках, наполняемых по мере надобности из бутылей (с соблюдением стерильности). Загрязненные растворы можно отфильтровать, но лучше всего сделать их заново, чтобы избежать неприятностей, вызываемых маленькими частичками, которые способны проходить через большинство фильтров, Растворы уранилацетата нужно защищать от света, обертывая соответствующую емкость фольгой; их необходимо фильтровать (диаметр пор фильтра 0,2 мкм), если образовался осадок, Удобно разливать растворы пластмассовым шприцем с насаженным на него фильтром типа БМппеу.
Распределение по подложке красителя и исследуемых частиц, даже если применяются уже упомянутые методы, может быть неудовлетворительным; поэтому для экономии времени и пользы дела следует готовить две или большее число сеток с одним и тем же материалом. Сетки просматривают в микроскоп прп малых увеличениях. Подходящая для эксперимента сетка, приготовленная путем промокания капли, характеризуется градиентным распределением частиц и красителя от одного края до другого, в пределах которого можно найти область с удовлетворительной плотностью частиц. Если в исходной суспензии концентрация частиц низка или промокание капли дает плохие результаты, то частицы и краситель могут быть найдены лишь на очень маленькой области сетки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
