Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 23
Текст из файла (страница 23)
2 многотомника 171.) Прямое отгенение испаряющимися металлами применяется по отношению к целым клеткам или их компонентам, бактериофагам или различным суспензиям; этот метод используется также для анализа реплик, приготовленных из интактных препаратов или при замораживании — скалывании и замораживании — травлении (см. ниже). Помимо очерчиваиия поверхностных неровностей и периодически повторяющихся структур, техника оттенения может применяться для измерения высоты образца по вертикали посредством нахождения длины тени и геометрических расчетов, опирающихся на известный угол оттенения. Измерению И7 ЧАСТЬ !. МОРФОЛОГИЯ помогает нанесение на сетку в целях калибровки стандартного объекта, такого, например, как латексные шарики известного размера.
Оттенение проводится следующим образом. 1. Исследуемый образец, не содержащий внешних загрязнений, предварительно фиксируют, но это не обязательно. 2. Образец помещают на покрытую формваром сетку и подсушивают. Сетку прикрепляют к липкой с обеих сторон ленте, находящейся на предметном стекле, вместе с маленьким кусочком тонкой фильтровальной бумаги, служащим визуальным индикатором количества напыленного при испарении металла.
(На части кусочка бумаги делают складки, чтобы иметь для сравнения напыленные и ненапыленные стороны.) 3. Предметное стекло помещают в напылительную установку на столик для образцов. (Мы применяем вращающийся столик ЕО1!ат аз 1205 в испарителе модели Чаг!Оп ЧЕ 10, снабженном охлаждаемой жидким азотом ловушкой для увеличения вакуумного разрежения.
В каждой лаборатории имеются свои приборы и приемы изменения угла оттенения между сеткой с образцом и нитью металла.) 4. Платино-палладиевую проволоку закручивают вокруг удерживаемой между электродами вольфрамовой нити (ЕО1!агп 1ЧЯ 1623), сделанной из стандартной вольфрамовой проволоки диаметром 0,7 мм. Платино-палладиевая проволока длиной 1 мм содержит 80ь/О платины и 200!ь палладия (Еп!!агп М 1221). Перед ее закручиванием сначала разогревают в вакууме вольфрамовую нить до белого каления и только после этого открывают испаритель и укрепляют платино-палладиевую проволоку.
(При этом происходит дегазация вольфрамовой нити, что улучшает вакуум во время последующего испарения металла и снижает напряжения, возникающие в проволоке при ее изгибе; это способствует увеличению срока службы нити.) 5. Источник металла — обмотанную вокруг вершины Ч-образной вольфрамовой нити платнпо-палладиевую проволоку — располагают примерно в 12 см над сетками под желаемым углом. После того как в нспарителе устанавливается хороший вакуум (10 ' мм рт. ст.), вклю- ! 18 4. ЭЛЕКТРОННАЯ МНКРОСКОПНЯ чают быстрый нагрев металла до точки плавления. В таком состоянии система находится до тех пор, пока не испарится весь металл или пока напыление на видимой глазом индикаторной фильтровальиой бумаге не покажется достаточным. Чтобы судить об этом, требуются некоторый навык и опыт.
6. Иногда, чтобы получить минимальный фон и меньшую по сравнению с платинопалладиевым сплавом зернистость, полезно применять напыление окисью вольфрама. Для этого У-образную вольфрамовую нить нагревают на воздухе, пока она не покроется желтой окисью вольфрама (%0з). Кристаллы окиси вольфрама счищают скальпелем, оставляя их лишь на вершине 11-образной нити; нить помещают в испаритель между электродами и далее проводят оттенение, как описано выше. 4.1.5. Получение реплик 144, 461 Реплики представляют собой слепки (отпечатки), которые ввиду их непрочности и прозрачности для электронов не подходят для прямого микроскопирования и должны напыляться металлом. Тонкие пленки материалов, прозрачных по отношению к электронам (обычно коллодия, формвара или поливинилового спирта).
находясь в контакте с изучаемыми поверхностями и структурами, образуют слепок, тем самым как бы очерчивая пх. Реплики, в которых в процессе отслаивания от поверхности-оригинала и перехода пленки в плавающее состояние оказались захваченными некоторые частицы, считают ложными. Получение реплик существенно для анализа поверхностей методом замораживания — скалывания и замораживания — травления. Обычно реплики готовят (с применением платино-углеродного напыления) на сколотых образцах, содержащихся при — 100'С. Техника замораживания †скалыван играет важную роль при исследовании внутренней структуры клеточной мембраны, а также образцов, которые не фиксировались и не изменялись путем химических воздействий. Однако для ее применения необходимо специальное оборудование и соответствующий опыт в работе.
Описание конкретных методов получения реплик выходит за рамки настоящего руководства 146 — 481. 119 ЧАСТЬ Ь МОРФОЛОГИЯ 4.1.6. Нуклеиновые кислоты С тех пор как вышла работа Кляйншмидта и Цана 174), нанесение отдельных молекул нуклеиновых кислот на белковый или другой мопослой с последующим контрастированием ураном и оттенеш1см вращающегося образца с целью микроскопирования стало широко распространенным приемом, претерпевшим некоторые модификации. Метод Кляйншмидта и Цана, чрезвычайно важный в молекулярной микробиологии и генетике микроорганизмов, хорошо описан в соответствующих работах 171 — 73, 751 и во многих специа,пьных публикациях.
Определение гомологин молекул плазмидных ДНК можно найти в равд. 15.3.5. 4,2. СКАНИРУЮ(ДАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ Характерные черты и преимущества сканирующей электронной микроскопии отмечались выше, в вводном разделе. Для бактериолога ценность микроскопии этого вида заключается в том, что с ее помощью можно получать трехмерное изображение микроорганизмов, различать детали строения поверхностей (в пределах разрешения) и выявлять пространственные взаимосвязи бактерий, растущих в виде разнообразных ансамблей.
Приготовление образцов включает в себя фиксацию находящегося на поверхности (например, на покровном стекле) материала, закрепление в держателе (этого этапа может не быть), иногда промывку и другие обработки, высушивание до критической точки или другими способами и обычно в напыление золотом или еще каким-либо тяжелым металлом в вакууме перед микроскопированием. На эти процедуры уходит довольно много времени, и для их выполнения нужны специальные навыки. Если учесть также недоступность сканирующего электронного микроскопа для многих лабораторий, то станет ясно, что исследователю, изучающему бактериальные структуры, по-видимому, не стоит начинать микроскопический анализ со сканирования — легче и быстрее достаточно детальную информацию можно получить с помощью негативного контр астирования.
Для 120 4. ЭЛЕКТРОН Н ЛЯ МН КРОО КО ПНЯ тех, кто имеет все необходимое и интересуется применением сканирующей электронной микроскопии для решения отдельных проблем, предлагаются многочисленные литературные источники [49 — 52, 64 — 701. 4.3. ФОТОГРАФИЯ Электронные микрофотографии являются итогом, отражающим деятельность микроскописта, поэтому правильная съемка и обработка фотографий представляют собой существенные этапы исследования.
Большинство микроскопов приспособлены для съемок на фотопластнны, рулонную пленку или и на то, и на другое. Рулонная пленка (35 мм) дешева и ее легко хранить. Стеклянные фотопластины легко бьются, тяжелы и требуют множества дорогих приспособлений для хранения. В настоящее время стеклянные пластины в основном заменены на покрытые эмульсией пленки, сделанные на основе эстара, которые устойчивы к изменению размеров и удобны для хранения. Основная трудность, связанная с работой с фотопленками, заключается в том, что как эмульсия, так и основа поглощают водяные пары. Поэтому предусмотрительный микроскопист хранит их покрытыми светонепроницаемыми пластинами вместе с набором алюмоосушителей.
Пластины делают из листа алюминия, идущего иа изготовление заслонки перед игольчатым вакуумным клапаном. Пленку, отрезанную на нужную длину, или отстоящие друг от друга стопки нарезанной пленки помещают для высушивания на подложку в виде сетки. На дио сосуда, находящегося в темной комнате, ставят поддон с пятиокисью фосфора, которую перемешивают при каждом его открывании и в случае необходимости заменяют. Умеренное разрежение и химический осуши- тель способствуют хранению пленки в сухом виде. Благодаря наличию предварительного вакуума устраняется необходимость продолжительной работы вакуумного насоса в электронном микроскопе. В некоторых микроскопах осушители встроены, но они редко удовлетворяют рекомендованным выше условиям хранения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
