Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 13
Текст из файла (страница 13)
З,З.З. Способ деления клеток Способ деления данной бактерии обычно не выявляется при первом поверхностном осмотре препарата; для этого требуются продолжительные наблюдения живых клеток в подходящей среде (5, 101. Методики простого окрашивания не позволяют с достаточной точностью определить, к какому типу относится деление— делению на две или на три клетки, делению почковани.
ем или фрагментацией. Для этой цели может оказаться необходимым окрашивание клеточной стенки или даже электронная микроскопия. 65 члсть ь мозгология З.ЗА. Подвижность Поступательное перемещение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев слабый или безыммерсионный сильный объектив. Скорость перемещения бактерий варьирует, и медленно движущиеся организмы следует отличать от тех, которым свойственно лишь броуновское движение. Описаны некоторые неподвижные мутанты, обладающие жгутиками (тип 11аг тог-). Чтобы убедиться в том, что жгутики действительно присущи данной бактерии, а также чтобы определить их расположение (полярное, перитрихиальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания (разд. 3.3.10). Если используется обычный конденсор и масляноиммерсионный объектив, для улучшения контраста количество света нужно уменьшить апертурной диафрагмой, а конденсор опустить.
Наиболее эффективный (и наиболее демонстративный) способ наблюдения за подвижными микроорганизмами при малом увеличении — это темнопольная микроскопия. Необходимые для нее специальные конденсоры доступны далеко не всем, однако вполне удовлетворительное темное поле можно получить, применив для освещения иммерснонный копденсор от фазово-контрастного микроскопа и расположенную на нужном месте фазовую пластинку; наблюдения при этом ведут с помощью обычных (не фазово-контрастных) объективов с увеличением 1ОХ или 45Х .
Иммерсионная жидкость на конденсор не наносится, а его положение, для которого характерно самое хорошее темное поле, находится экспериментальным путем. С помощью этого ухищрения оказывается возможным видеть под малым увеличением даже спирохет1 Некоторым бактериям присущ особый тип поступательного движения при контакте с твердой поверхностью, известный как «скольжение». Это относительно медленное, моментами прекращающееся, а затем возобновляющееся продвижение в направлении, параллельном продольной оси организма. Для скольжения характерна частая смена направлений движения и отсутствие наружных локомоторных органелл [81.
Такого типа подвижность можно предположить, если при микроскопиче- э. мвтоды идентиФиклции В сВВТОВОВ микРОскОпии ском обследовании (с безиммерсионными объективами большого увеличения) краев колоний обнаруживают отделенные от самого края одиночные клетки или группы клеток. Часто в первичной среде выделения скольжение не выявляется; обычно его легче обнаружить на твердых средах с небольшим количеством питательных веществ, соответствующих их содержанию в естественной для данной группы среде обитания.
Скольжение следует отличать от роения, которое выражается в движении за счет жгутиков в особых условиях, Роение — это распространение микроорганизмов по относительно сухим поверхностям, например агара, где они движутся в виде больших протяженных островков или микроколоний 16]. У наблюдаемых при этом скоплений постоянно меняются очертания — от коротких языковидных выступов и изолированных групп до переплетающихся полос, чередующихся с пустотами. В местах этих пустот видны следы движения, часто рассматриваемые в качестве признака скольжения и хорошо сохраняющиеся фиксацией по Боуэну 1п зйп (равд.
2.2.1). Молодые активные культуры нитевидных организмов, передвигающихся скольжением, оставляют волнообразные, завитые или спиралевидные рисунки. Поступательное перемещение путем скольжения происходит со скоростью 10 — 15 мкм/с. 3.3.5. Окраска по Граму Окраска по Граму представляет собой самый важный метод идентификации бактерий. Теоретически возможно разделение бактерий на две гпуппы: гоамположительные и грамотрицательные; реально же имеются случаи, когда одни и те же бактерии характеризуются как «грамвариабельные». С тех пор как метод был впервые разработан Кристианом Грамом в 1884 г., опубликованы многочисленные модификации окраски по Граму.
Пленка бактерий для окрашивания на предметном стекле может быть получена прямым методом из культуры в жидкой нли твердой среде [случай простого окрашивания (разд. 3.2.5)1, но лучше всего приготовить ее из фиксированной формалином отмытой пробы. Несколько дополнительных минут, потраченных на суспендирование бактерий в 57Р-ном (объем/объем) формали- 67 ЧАСТЬ 1. МОРФОЛОГИЯ 20 мл не, сбор и промывка их центрифугированием, окупаются тем, что при этом размер и форма клеток хорошо сохраняются, клетки прокрашиваются равномерно, а беспорядочно разбросанные преципнтаты из жидких культуральных сред отсутствуют. В любом случае рекомендуется высушивать пленку на воздухе и фиксировать ее нагреванием, как для простого окрашивания.
Важно стандартизировать методику окраски по Граму 141. Одина- новые результаты дают два способа окраски — в модификации Хукера и в модификации Берка. Окраска по Граму в модификации Хукера Раствор А для приготовления красящего реактива: Кристаллический фиолетовый (с гарантированным 2,0 г 90ья-ным содержанием сухого вещества) Этанол 95ть-ный (объем/объем) Раствор В для приготовления красящего реактива: Шавелевокислый аммовий 0,8 г Дистиллиронапная вода 80 мл Растворы й и В смешивают для получения красящего реактива кристаллического фиолетового.
Оставляюг на 24 ч и перед использованием фильтруют через фильтровальную бумагу. Протрава: Йод 1,0 г Йодистый калий 2,0 г Дистиллированная вода 300 мл Йод н иоднстый калий размельчают в ступке и медленно добавляют воду при постоякно продолжающемся размсльчении, пока иод не растворится. Храпят в темной склянке. Расгворитель для обеспвечиванищ Этанол 95%-ный (объем/объем) Дополнительный красителю Сафрании О [2,5'1е (вес/объем) в 95ей-ном (объ- 1О мл ем/объем) зтаноле) Дистиллированная вода 100 мл Методика: 1.
Высушенную на воздухе фиксированную нагреванием бактериальную пленку погружают на 1 мин в красящий раствор кристаллического фиолетового. 2. Пленку промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды в течение 2 с. 3. Пленку помещают в полную протраву на 1 мин. 4. Промывают пленку в слабой, идущей под углом а. методы идентионкяцни в световои микроскопии струе водопроводной воды в течение 2 с, после чего ее подсушивают промокательной бумагой. 5. Погружают пленку на 30 с в 95е)о-ный (объем/объем) этанол, взбалтывая последний, после чего пленку подсушивают промокательной бумагой.
6. Погружают пленку на 10 с в дополнительный краситель. 7. Промывают пленку в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке, после чего пленку подсушивают промокательной бумагой. 1,0 г 100 мл 2,0 г Методика: 1. Высушенную на воздухе фиксированную нагреванием бактериальную пленку погружают в раствор Л, добавляют 2 — 3 капли раствора В н выдерживают в течение 2 мин. 2. Отмывают пленку иодной протравой, после чего покрывают ее на 2 мин свежей протравой. 3: Пленку промывают в слабой, идущей под углом струе воды из-под крана в течение 2 с; поверхность во- Окраска по Граму в модификации Берка Раствор А: Кристаллический фиолетовый (с гарантированным 90ьа-ным содержанием сухого вещества) Дистиллированная вода 100 мл Раствор Вв Даууглекислый натрий Днстиллиронанная вода Иодная лротрава: Иод 1,0 г Иодистый калий 2,0 г Дистиллированная вода 100 мл Протраву готовят так же, как при модификации Хукера, Растворитель длл ойесцвенивания (Преддлреасдение: осторожно, легко воспламеняется!): Этиловый эфир Ацетон Дополнительный краситель: Сафранин О (с айь(ь-ным содержанием сухого нещестна) Дистиллированная вода !00 мл ЧАСТЫ.
МОРФОЛОГИЯ круг пленки подсушивают промокательной бумагой, но саму пленку предохраняют от высыхания. 4. На пленку при наклонном положении предметного стекла по каплям наносят обесцвечивающий раствори- тель до тех пор, пока в скапывающем со стекла растворителе не исчезнет окраска. После этого пленку подсушивают на воздухе.
5. На 5 — 10 с пленку погружают в дополнительный краситель. 6. Пленку промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке и подсушивают ее промокательной бумагой. При использовании любой из методик грамположительные бактерии окрашиваются в голубой или фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в красный. Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальная пленка слишком толста, а обесцвечивание не проведено до конца.
В то же время грамноложительные микроорганизмы могут выглядеть, как грамотрицательные, если пленка чересчур обесцвечена; особенно это характерно для культур, очень долго находившихся в стационарной фазе роста. Некоторые виды Вас111из грамположительны лишь в течение нескольких делений после прорастания спор. Грамположительные организмы могут окраситься как грамотрицательные, если нарушена механически целостность их клеточных стенок в результате гибели клеток, автолиза, действия ферментов (например, лизоцима), высушивания на стекле и последующего увлажнения. Для получения хороших результатов лучше всего готовить относительно прозрачные пленки 1со слабой замутненностью) из молодых активно растущих культур, так как более старые культуры имеют тенденцию давать неустойчивые реакции.
Целесообразно в качестве контроля использовать известные грамположительные н грамотрицательные микроорганизмы. 3.3.6. Окрашивание иа кислотоустойчивость Второе важное тинкториальное свойство бактерий заключается в том, что некоторые из них плохо обесцвечиваются смесью кислота — спирт после окрашивания го- 70 3. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ В СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ рячими растворами карболфукснна. В эту маленькую группу, известную под названием «кислотоустойчнвая», входят некоторые актиномицеты, мнкобактерии, отдельные родственные им бактерии и покоящиеся эндоспоры. Метод окрашиваиия на кислотоустойчивость по Цилю — Нильсену Карболфуксиновый красителю Основной фуксин 0,3 г Этанол 95'~ь-ный (объем/объем) 1О мл гренол (кристаллы, расплавленные при нагревании) 5 мл Дистиллированная вода 95 мл Основной фуксии растворяют в зтаиоле и затем добавлягот растворенный в воде фенол.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
