Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Клетки, интенсивно окрашенные для общеморфологического изучения, получают погружением на короткий срок препаратов, фиксированных нагреванием нли химическими агентами, в растворы основных красителей, таких, как кристаллический фиолетовый (на 10 с) и метиленовый синий (на 30 с), после чего их промывают водопроводной нли дистиллированной водой и подсушивают впитывающим воду материалом. Готовят красители следующим образом: Кристаллический фиолетовый (по Хукеру) Кристаллический фиолетовый Этанол 957,-ный (объем/объем) )Цавелевокислый алгмоний 1ь -ный (вес/объем) водный Кристаллический фиолетовый растворяют в этаноле, затем добавляют раствор щавелевокислого аммония и выдерживают перед использованием 48 ч. Метиленовый синий (по Лефлеру) Метиле44овый синий солянокнслый 1,6 г Этанол 95%-иый (объем/объем) !00 мл КОН 0,0191-ный (вес/объем) водный 1ОО мл Готовят насыщенный спиртовой раствор метилеиового синего, добавляя краситель к спирту.
Затем вливают ЗО мл этого раствора в раствор КОН. ЧАСТЬ ! МОРФОЛОГИЯ Если клетки окрашиваются слабо или совсем не окрашиваются одним из этих красителей, то их можно окрасить карболфуксином; прн этом не исключено, что они окажутся кислотоустойчивыми в отношении красителя (равд. 3.3.6). Для большинства бактерий достаточно выдержать в этом красителе несколько секунд; это очень мощный краситель, и часто ои дает чрезмерную окраску. Однако в случае мнкобактерий необходимо нагревание или добавление поверхностно-активных веществ, причем, для того чтобы карболфуксин проник через клеточную стенку, содержащую воскоподобные компоненты, требуется какое-то время.
3.2.6. Постоянные препараты Окрашенные бактериальные пленки на покровных стеклах можно смонтировать в препарат, заключив их в воду на предметном стекле и запечатав края покровного стекла петролатумом, прозрачным лаком для ногтей или свечным воском. Такие препараты временны, их можно использовать лишь в течение нескольких дней, опи представляют собой превосходный материал для мнкрофотографирования. Чтобы увеличить срок хранения, окрашенные и высушенные на покровном стекле пленки бактерий нужно осветлить в ксилоле и положить на каплю канадского бальзама на предметное стекло; следует избегать применения избыточного количества бальзама, а в крайнем случае вытирать его тканью, смоченной в ксилоле.
Имеются в продаже и нейтральные среды для заключения препаратов, такие, как, например, флотекс, ВРХ и пермауит. Этн среды состоят из пластмассы (полистирол) с пластификатором (трикрезилфосфат), растворенной в органических растворителях (толуол, кси. лол). Флотекс можно наносить прямо на окрашенную бактериальную пленку, находящуюся на предметном стекле, без применения покровного стекла.
Пермаунт является нейтральной средой, которая не закисляется и не обесцвечивается при хранении; прн заключении в пермаунт удается избежать накопления пузырьков воздуха под покровным стеклом. Х МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ В СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ 3.3. ОБНАРУЖЕНИЕ ПРИЗНАКОВ Как было показано, описываемые ниже методы удовлетворительны для выявления характерных признаков бактерий, необходимых для нх идентификации.
Вместе с тем их можно улучшить или модифицировать; литература изобилует описаниями незначительных изменений, которые, как выяснилось, были необходимы для получения оптимальных результатов в специфических условиях. В особой заботе при фиксации, окраске и микроскопировании нуждаются цитологические препараты. Меры предосторожности, которые необходимы при работе с ними, приводятся здесь, а также в гл. ! и 2.
Методы, которые описаны ниже, считаются рутинными, но это самые эффективные методы (особенно если дело касается цитоплазматических включений) применительно к химически фиксированным препаратам, при обработке которых на всех этапах избегают высушивания. 3.3.1. Размер К сожалению, измерения длины и ширины бактерий далеко не всегда проводятся с необходимой точностью из-за неизбежных технических трудностей. Границы клеток живых бактерий, исследуемых в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе, видны не четко. При фазово-контрастной микроскопии границы клеток плохо видны из-за ореолов, которые ухудшают также видимость деталей внутреннего строения. Улучшения можно достичь, поместив микроорганизмы в среду с большим показателем преломления, что нетрудно сделать, если добавить желатину до концентрации 15 — 30'/о (вес/объем) [9).
Точную концентрацию, при которой получают наилучшие результаты, нужно определять экспериментально для каждого типа микроорганизмов и их компонентов. Менее точный метод заключается в быстром высушивании на предметных стеклах тонкой пленки 15 — 20%- ного (вес/объем) раствора желатины.
Пленки применяют для монтирования препаратов в жидкой среде; желатина при этом набухает, иммобилизуя погру>кенные в нее часть ь мОРФОлогия клетки, и благодаря ее присутствию улучшаются фазовые соотношения между микроорганизмом и средой. В фиксированных и окрашенных препаратах микроорганизмы в некоторой степени деформируются, причем степень деформации зависит от примененной методики; понятно, что при этом получают лишь приблизительные размеры. В высушенных окрашенных пленках, даже если они приготовлены из фиксированного формалином материала, не выявляется клеточная стенка. Обработка клеток дубильной кислотой и окраска кристаллическим фиолетовым делают клеточную стенку видимой, но при этом ширина бактерий больше по сравнению с той, которая характерна для живых клеток в жидкой среде или в окрашенных препаратах после высушивания на стекле. Эта методика не очень хороша для грамотрнцательных бактерий.
Микроскопические измерения производятся с помощью либо калиброванного окуляра-микрометра, либо фнлярного микрометрического окуляра. Окуляр-микрометр, состоящий из стеклянного диска, на котором имеется ряд регулярно расположенных условно обозначенных отметок, устанавливается поверх полевой диафрагмы окуляра после отвинчивания верхней части. Объект- микрометр — это стеклянная пластинка, специально размеченная линиями, отстоящими друг от друга ровно на 10 мкм; при наведении на фокус линии окуляра-микрометра накладываются на линии объекта-микрометра, Если, к примеру, между двумя соседними линиями последнего помещается 10 линий окуляра-микрометра, то каждый просвет между ними равен 1,0 мкм. После калибровки объект-микрометр больше не нужен, но для каждого применяемого объекта калибровку следует проводить заново.
Филярный микрометрический окуляр имеет измерительную нить, положение которой регулируется вращающейся микрометрической ручкой. Каждому полному обороту ручки соответствует номинальное значение 1О мкм, нить при этом смещается на 1,0 мм. Переместив нить на известное по объекту-микрометру расстояние и подсчитав число делений на барабане ручки, пройденных при этом, можно прикинуть, сколько микрометров приходится на одно деление барабана.
3. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ В СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ 3.3.2. Форма Для идентификации и в описательных целях (гл. 20) форму бактерий принято обозначать следующим образом: прямая, изогнутая, спиральная, коккобациллярная, ветвящаяся, плеоморфная, с квадратным концом, с округлым концом, лентовидная и веретеновидная. К этим классическим терминам можно, пожалуй, добавить звездчатую, стебельчатую и дольчатую формы. Взаимное расположение отдельных бактерий описывается такими терминами, как одиночные пары, короткие цепи (менее пяти бактерий), длинные цепи (более пяти бактерий), скопления, тетрады, октеты, комки и нити. Когда в учебнике бактерии описываются с помошью этих терминов, подразумевается, что природные ансамбли не нарушены. Вместе с тем при чрезмерном встряхивании, например, длинные цепи клеток могут разбиваться, а из одиночных клеток могут образовываться комки.
Разрушение длинных цепей или других непрочных группировок клеток сводят к минимуму добавлением к культуре формальдегида до 1 — 2% (объем/объем); культуру инкубируют с формальдегидом 15 мин, затем ее центрифугируют и ресуспендируют в воде для приготовления пленок или негативного окрашивания. Эта процедура особенно рекомендуется для стрептококков, Следует также принимать во внимание последствия, связанные с возрастом культуры и составом среды.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
