Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 6
Текст из файла (страница 6)
28 Ь СВЯТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ 9. Вставляют окуляр и устанавливают соответствующие светофильтры для визуальных наблюдений или фотографирования. 10. Те же принципы применяются и к безыммерснонным объективам, но в этом случае нет необходимости наносить иммерснонное масло на конденсор, если качество последнего удовлетворительное. 1.4. ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ В люминесцентном микроскопе к оптике предъявляются те же требования, которые были описаны выше в случае обычного исследовательского микроскопа. Различия в эксплуатации и конструкции относятся к генерированию и передаче света с длинами волн, пригодными для возбуждения флуоресцирующих красителей (флуорохромов) или естественной флуоресценции в объекте, а также к детектированию света для тех длин волн, которые возникли в объекте в результате флуоресценции.
Поскольку для возбуждения нужны, как правило, малые длины волн в области, близкой к ультрафиолетовой, лампа (обычно ртутная дуговая лампа высокого давления), линзы конденсора н любые другие линзы на пути от лампы к объекту должны быть изготовлены из материала (обычно флюорнт), хорошо пропускающего свет таких длин волн. Существенным моментом является использование зеркала с передней отражающей поверхностью (без стеклянного слоя). Иммерсионное масло для объектива н конденсора не должно флуоресцировать (напрнмер, специальное синтетическое масло или масло сандалового дерева).
Самое главное для микроскописта — правильно расположить светофильтры на пути света. В приборах разных фирм-изготовителей светофильтры расположены по-разному, однако для ннх существуют следующие общие принципы: 1. Между объективом и окуляром должен находиться запирающий светофильтр, отсекающий ультрафиолет. Этот светофильтр защищает глаза от вредного воздей ствия ультрафиолета. 2. Между лампой н объектом должны располагаться возбуждающие и задерживающий светофильтры. Воз.
ЧАСТЫ. МОРФОЛОГИЯ буждпющиз светофильтры представляют собой интерференционные фильтры с узкой областью пропускания (например, 365 нм), соответствующей используемому флуорохрому. Они непрозрачны для большей части видимого света, и поэтому фон, видимый глазом при просмотре препарата, получается черным или темно-синим. Задерживающий светофильтр отсекает ультрафиолет, ко пропускает видимый свет, что необходимо для выбора поля зрения и предварительной фокусировки при обычном освещении. Системы освещения могут быть разных типов: 1) с передачей света через конденсор, находящийся под предметным столиком, 2) темнопольное освещение с использованием специального конденсора и 3) верхнее освещение через объектив. Системы второго и третьего типа обладают преимуществами эффективной темнопольной системы, поскольку возбуждающий пучок не дает избыточного постороннего света для глаза н не мешает выявлению более слабого флуоресцентного света от образца.
В системе третьего типа конденсором служит объектив, вследствие чего отпадает проблема центрирования. Одновременно при этом сводятся к минимуму потери слабого излучения флуоресценции, обусловленные поглощением в толще образца. Возбуждающий пучок отражается вниз по направлению к объективу с помощью светоделительного зеркала, которое находится в боковом окне тубуса микроскопа.
Это зеркало отражает свет с возбуждающими длинами волн, но пропускает видимый свет, функционируя, таким образом, в качестве барьерного светофильтра. Клетки или другой исследуемый материал реагируют с флуорохромами (например, с ксантиповыми, акридиновыми, хииолиновыми производными и т. д.) как с красителями, а также с веществами, которые высвобождают флуорохромы (например, флуоресцеин). Это позволяет проводить локализацию и распознавание антигона.
О том, как обращаться с микроскопом и светофильтрами, а также о необходимых предосторожностях лучше всего узнать у человека, имеющего опыт работы с микроскопом, или прочитать в руководствах, выпускаемых изготовителями. Получаемые результаты можно фиксировать иа пленке, цветной или черно-белой. ~ сввтоахя микгоскопня В связи с тем, что: 1) выход флуоресценции мал (меньше 1: 100), 2) флуоресцирующая часть образца незначительна (в большинстве случаев) и 3) для большинства флуорохромов характерна тенденция флуоресценции к затуханию со временем, интенсивность флуоресценции, как правило, низка н поэтому мы рекомендуем следуюшее: 1. Работать в темноте или в хорошо зашторенной комнате. 2.
Не применять линз и светофильтров, в которых нет необходимости (не нужно и матовое стекло у осветителя), и укорачивать световые пути настолько, насколько позволяет система. 3. В случае вспомогательных линз проверять, в каком положении они дают наибольшее количество света. Полностью открывать конденсорную (апертурную) диафрагму. 4. Использовать окуляры малого увеличения (8Х), поскольку интенсивность воспринимаемого флуоресцентного света находится в обратной экспоненциальной зависимости от общего увеличения. 5. Для фотографирования использовать высокочувствительные пленки.
6. Если имеется возможность, пользоваться верхним, а не нижним освещением. 1.5. ИММЕРСИОННЫЕ МАСЛА Иммерсионные масла предназначены для использования с иммерсионными объективами, благодаря чему передней линзе объектива обеспечивается среда с необходимыми преломляюшнми свойствами. Их показатель преломления близок к показателю преломления стекла, поэтому масло и стекло составляют однородную систему. Иммерсионные масла «проясняют» также высушенный на стекле бактериологический препарат благодаря тому, что онн проникают в окрашенные клетки и покрывают их. Имеющиеся в продаже масла, рекомендованные изготовителями микроскопов, проверены и с гарантией не оказывают кислотного или растворяющего воздействия на линзы или их крепления; заменители не рекомен- 3! ЧАСТЬ Ь МОРФОЛОГИЯ дуются, их использование может привести к ложной экономии.
Выбор масла зависит от конкретных требований. Может, например, потребоваться особо вязкое масло, если нужно, чтобы оно заполняло очень широкие промежутки или не вытекало при работе с горизонтальным или обращенным микроскопом, а для люмннесцентной микроскопии особенно важно, чтобы масло возможно меньше флуоресцировало. Для общих целей предпочитают масло с высокой вязкостью (мы используем масло типа В с вязкостью 1250 сП фирмы Сагйч(!!е 1аЬога1оНез 1пс., Себбаг Сгоче, Ы 07009), которое почти не стекает н не растекается. Единственная трудность, порождаемая высокой вязкостью, заключается в более длительном удержании маслом пузырьков воздуха, но этого можно избежать.
Иммерсионные объективы следует всегда протирать после использования или по крайней мере в конце рабочего дня. Современные неокисляюшиеся масла доставляют меньше забот, чем традиционное кедровое масло (которое затвердевает и оставляет неприятные следы), но и они все же претерпевают медленные изменения; к тому же они могут затечь куда не следует. Предупреждение. Масла безопасны в работе, но до 1972 г. в их состав часто входили производные полихлорированного дифенила, которые в настоящее время признаны канцерогенными н токсичными; поэтому просмотрите старые пузырьки! Никогда не берите масла больше, чем нужно (обычно хватает одной капли).
Хороший пузырек для масла помогает уменьшить беспорядок в работе. Используйте либо сжимаемый пузырек, либо стеклянный пузырек с широким основанием и приспособлением для нанесения масла (стеклянная палочка или проволочная петля), которое прикреплено к крышке пузырька. Среди лучших вариантов укажем двухкамерный пузырек, в котором крышка превращена в емкость для масла, а внизу содержится ксилол для протирки.
Приведение в контакт конденсора с нанесенным на него маслом и предметного стекла может быть самой трудной операцией для тех, у кого не очень хорошие руки. Масло должно обладать высокой вязкостью, и при работе с ним необходимо соблюдать некоторые предо- 32 ! СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ сторожности как при установке, так и при удалении пре- парата. Лучше всего действовать так: 1. Навести каплю масла на верхнюю линзу конден- сора, после чего опустить конденсор ниже уровня пред- метного столика. При нанесении капли следить за тем, чтобы в масло не попадали пузырьки воздуха. 2. Нанести каплю масла на нижнюю сторону пред- метного стекла под тем местом, которое вы хотите про- смотреть. 3. Опустить предметное стекло на предметный сто- лик микроскопа так, чтобы капля оказалась в центре отверстия, и придерживать предметное стекло, подгоняя препаратоводитель или зажимы, которые должны его фиксировать.
4. Поднять конденсор так, чтобы обе капли встре- тились и чтобы его верхняя линза была полностью по- крыта маслом, 5. Установив нужный объектив на фокус, настроить кондеисор, чтобы получить освещение по Келеру (равд. 1.3.1). 6. При разборке системы, прежде чем убрать пред- метное стекло с образцом, следует опустить конденсор. В результате активных боковых перемещений масло мо- жет затечь под предметный столик. Об этом нужно пом- нить и каждый раз проверять, протирая после работы специальной бумагой верхнюю линзу.
7. Для нанесения иммерсии годятся только кондепсо- ры с несъемной или навивчивающейся верхней частью. Наносить масло на подвижную верхнюю часть некото- рых «универсальных» конденсоров (т. е. часть, которую с помощью рычажка отводят в сторону при работе с низким увеличением) нужно в высшей степени осторож- но или не наносить его совсем. 1.6. УХОД ЗА МИКРОСКОПОМ Микроскопы отличаются прочностью и долговечностью. При надлежащем уходе и некоторой защите (особенно от неблагоприятного воздействия содержащего кислоты воздуха некоторых лабораторий) они прослужат положенный им срок или даже больше.
Однако ЧАСТЬ 1 МОРФОЛОГИЯ для этого необходимо выполнять следующие правила по уходу за микроскопом. 1. Защищать микроскоп от попадания песка и пыли. Следует зачехлять микроскоп, когда он не используется; лучше всего использовать жесткий прозрачный стеклянный или пластмассовый колпак, вмещающий в себя микроскоп и его принадлежности. Не допускать скопления пыли, которая может проникнуть в линзы и механические части микроскопа. 2. Чистить и смазывать движущиеся части, особенно реечный механизм и шестерни (подойдет смазка для шестерен игрушечных поездов, имеющихся в соответствующих магазинах) следует по возможности реже.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
