Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 5
Текст из файла (страница 5)
сВетОВАя микгоскопия увеличить до значения показателя преломления оптического стекла (т. е. до 1,5150) применением иммерсионного масла. Именно зто позволяет нам поднять числовук> апертуру до значений выше 1,0 и, создав определенные условия, полностью использовать разрешающую силу дорогостоящих объективов со значениями апертур 1,30 или 1,32, выбитыми на их сверкающих оправах. Ахроматические и апохроматические объективы с большой числовой апертурой исправлены на сферическую аберрацию и на хроматическую аберрацию для двух или трех цветов в центре поля зрения (где в основном проводится работа при большом увеличении).
Объективы обоих типов работают почти одинаково хорошо, оправдывая свою цену, особенно когда применяются узкополосные (интерфереиционные) светофильтры. Объективы, наиболее подходящие для выполнения поставленной задачи, важно дополнить окулярами соответствующего качества. Для итого нужны компенса>)ионные окуляры, названные так потому, что «они рассчитаны на исправление боковой хроматической ошибки, возникающей при увеличении в линзах объективов с большой апертурой и хорошей коррекцией аберраций» (3].
Имеющийся опыт подтверждает правильность совета Шилабера 19], согласно которому «компенсационные окуляры должны иметь большую силу, желательно 15Х или 20Х. Возможности применения апохроматических объективов в сочетании с высокоразрешающими окулярами должны использоваться полностью; в противном случае тонкие детали, которые с их помощью могут быть выявлены на микрофотографиях, останутся невыясненными».
Для тех, кто носит очки с сильными линзами, удобно и полезно приобрести специальные окуляры, с которыми можно работать в очках. Оптимальная работа высокоразрешающих объективов зависит от оптимального освещения. Поле зрения должно быть освещено равномерно, яркости должно хватать для фотографирования.
Свет от спиральных нитей ламп распределяется по их поверхности и, следовательно, по их изображению неравномерно, если он не рассеивается специальным матовым стеклом. Самыми лучшими бесструктурными источниками света стандартной яркости являются небольшие ртутные или цирконие- 25 члсть ь моээология вые дуговые лампы и менее дорогие удобные проекционные лампы с вольфрамовой бусинкой нли ленточной нитью, изображение которых может целиком заполнить конденсор. Для широко применяемой системы освещения по Келеру (равд. 1.3.1) требуется оснастить лампу микроскопа двумя дополнительными устройствами: си.
стемой линз, способной проецировать резкое изображение источника света на входную плоскость конденсора, и находящейся перед этими линзами ирисовой полевой диафрагмой (см. ниже методику Келера). Нейтральные светофильтры (оптическне пластины с алюминиевым покрытием) позволяют регулировать яркость до удобного для глаза уровня, а цветные светофильтры сужают спектр используемых для освещения длин волн.
Имеются два вида цветных светофильтров: дорогие интерференционные светофильтры, пропускающие узкую область спектра и состоящие из двух полупосеребренных пластин со строго определенным зазором между ними, н рэтен-фильтры (Кодак), состоящие из двух квадратных стеклянных пластин (сторона квадрата 5 см) с полировкой оптического качества, между которыми заключен слой окрашенной желатины. Со временем зти светофильтры подсыхают нз-за проникновения воздуха с ребер, однако они выпускаются в широком ассортименте цветов и плоскостей и являются ценными принадлежностями микроскопа. Красный светофильтр (рэтен № 29) или оранжевый светофильтр (рэтен № 22) делают плотные структуры прозрачными, а структуры, окрашенными голубыми красителями, более контрастными.
Зеленый светофильтр (рэтен № 58В) применяется чаще других в связи с тем, что именно к зеленому цвету наиболее чувствительна наша сетчатка, а также потому, что обычно используемые в гистологических исследованиях красители имеют красный цвет и при наблюдении через зеленый светофильтр контраст изображения сильно возрастает. Зеркала с задней отражающей поверхностью (т. е. имеющие зеркальную поверхность за слоем стекла) хороши в повседневной работе и долговечны.
Однако они не дают оптимального освещения, поскольку отражении источника света с передней поверхности стекла и с задней, где находится отражающий слой металла, не совпадают и перекрываются, То же происходит с изображе- ь сввтовля микРОскОпия нием отверстия полевой диафрагмы, когда к окончательно получаемому изображению добавляется нежелательный рассеянный свет (методика Келера). Зеркала же с передней отражающей поверхностью не имеют защитного покрытия и дают лишь единственное отражение. Самый важный элемент на пути света от лампы к объективу и к глазу — это конденсор, находящийся под предметным столиком. Апертуры объективов со значениями от 1,30 до 1,32 будут полностью эффективны только в том случае, если числовая апертура конденсора равна им по величине или больше.
Такие конденсоры также обычно бывают ахроматическими или апланатическими, соответствуя в этом отношении описанным выше объективам. Здесь следует вспомнить о роли показателя преломления в выражении для числовой апертуры: разрешающая способность объективов с большой числовой апертурой реализуется только тогда, когда среда, через которую проходит свет после его поступления в конденсор и прохождения через объект и систему линз объектива, является однородной и стеклоподобной на всем пути.
Иными словами, высокое разрешение получают тогда, когда иммерсионное масло находится между конденсором и предметным стеклом, а не только между покровным стеклом и линзой объектива. Если в исследовательском микроскопе все налажено: окуляр, объективы, конденсор соответствующего качества, зеркало с передней отражающей поверхностью, на которое от яркого однородного источника поступает свет, прошедший через зеленый светофильтр, — он готов к работе. Чтобы проявились все его достоинства, необходима только хорошая подготовка препарата.
1.3.1. Освещение по Келеру Для иммерсионного объектива освещение по Келеру (почти оптимальное освещение) достигается следующим образом: 1. Фокусирование изображения нити лампы осуществляют с помощью белого листка, помещаемого на зеркале под конденсором. При этом лампу располагают так, чтобы изображение нити (предпочтительно ленточной) целиком заполняло отверстие конденсора; это можно увидеть, убрав листок с зеркала. 27 ЧАСТЬ Ь МОРФОЛОГИЯ 2. Для визуальных наблюдений на пути света устанавливают соответствующие светофильтры. Полностью открывают все диафрагмы. Если используется лампа со спиральной нитью, то вблизи конденсора (разя. 1.1) помешают матовое стекло.
3. На копденсор наносят масло (одну каплю масла с высокой вязкостью) и поднимают его до соприкосновения с такой же каплей, нанесенной на предметное стекло (равд. 1.5), 4. При снятом окуляре приблизительно центрируют освещение глядя на заднюю линзу объектива с маленьким увеличением, в фокусе которого находится препарат. При этом регулируют положение зеркала н конденсора на максимальное центрирование и равномерное освещение.
Пузырьки воздуха в масле н другие помехи общего характера легко выявляются в этих условиях и должны быть по возможности устранены (равд. 1.1). 5. Вставляют окуляр и просматривают препарат в целом, чтобы найти интересующие области. 6. На покровное стекло наносят масло (равд. 1.5), меняют объектив на иммерсионный и устанавливают фокус. 7. Делают отверстие диафрагмы лампы минимальным н фокусируют его край конденсором в плоскости препарата (при этом в фокусе находятся и объектив, н конденсор).
Вновь регулируют отверстие диафрагмы лампы так, чтобы ее край совпадал с краем поля зрения. Замечание. Если по краям диафрагмы лампы образуется неравномерная цветная бахрома, то конденсор требует центровки. Для этого поворотом двух его регулировочных ручек следует смещать конденсор в ту сторону, где бахрома окрашена в красный цвет, центрнруя апертуру зеркалом по мере движения. Смещение прекращают, когда цвета бахромы распределятся симметрично. 5. Удалив окуляр (увеличение которого должно быть не меньше 12Х или 15Х) и глядя вниз через тубус, уменьшают апертурную диафрагму конденсора, чтобы устранить блики н отражения. Уменьшение не должно составлять больше '/ы диаметра задней линзы объектива; чрезмерное уменьшение снижает разрешающую способность.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
