Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 4
Текст из файла (страница 4)
2. Помещают предметное стекло с препаратом на предметный столик и фокусируют объектив до получения резкого (не обязательно хорошо освещенного) изображения объекта, которое следует максимально улучшить регулировкой апертурной диафрагмы и положения кондеисора. 3.
По нашему опыту лучший способ определить оптимальное положение конденсора состоит в следующем. Снимают окуляр и смотрят через тубус на заднюю поверхность линзы объектива. В это же время регулируют положение конденсора таким образом, чтобы освещение объектива было самым полным и равномерным. Любое нарушение центрировки можно выявить и исправить поворотом зеркала.
Затем уменьшают блики, закрывая диафрагму конденсора (если она есть) как раз настолько, чтобы освещенный участок задней линзы объектива только-только начал уменьшаться. Эту операцию выполняют для каждого объектива при первоначальной фокусировке на данный объект. 4. Возвращают окуляр на место и производят окончательную регулировку, добиваясь наилучшего освещения. 5. Поворотом револьвера с объективами устанавливают любой другой обьсктив.
Многие фирмы, производящие микроскопы, поставляют парафокальные объективы (т. е. объективы, у которых фокальные плоскости почти совпадают). При установке остается достаточный зазор для безыммерсионных объективов. Если же объективы не парафокальны, перед фокусированием иммерсионных объективов, ямеющих малые фокальные расстояния, нужно слегка приподнять тубус микроскопа. Зазор становится еще меньше, если препарат накрыт по- кровным стеклом.
6. Если смотрят препарат с иммерсней, то наносят каплю масла на стекло с препаратом (в центр препарата) перед тем, как поместить его на предметный столик. Если же предварительно требуется отыскать нужное поле зрения при малом увеличении, то каплю масла удобно нанести, когда револьвер находится в промежуточном положении при переходе с одного объектива на 20 ! сввтовля микРОскОпия другой, перед тем как иммерсионный объектив окажется над каплей с маслом.
7. Чтобы научиться обращаться с иммерсионным Объективом и фокусировать его, нужен некоторый практический навык и осторожное обращение с микроскопом (разд. 1.5 и 1.6), даже если передняя часть объектива способна вжиматься в целях защиты как линзы, так и предметного стекла от микроскописта с плохими руками. Глядя сбоку на предметное стекло, опускают объектив до поверхности масляной капли, а затем еще немного. Объектив опускают осторожно при помощи макровинта и следят за появлением изображения препарата, глядя в окуляр.
После того как оно появляется, пользуются микровкнтом. Настраивают освещение, как описано ранее, н подбирают оптимальное на свой глаз. 8. Если изображение неясное, плывет или только тусклое и нерезкое, значит, что-то сделано неправильно. Может быть, нуждается в очистке фронтальная линза объектива (для этого используют бумагу для линз). С иммерсионными объективами часто получается плохая картина из-за пузырьков воздуха в масле (пузырьки легко выявляются, если снять окуляр и посмотреть вниз через тубус). В этом случае поднимают объектив или поворачивают револьвер, чтобы вытереть с объектива масло (обычно пузырьки переходят на объектив) и вновь фокусируют изображение. Причиной плохого изображения может также служить случайно закрытая диафрагма, сдвинутая лампа или зеркало.
Устранение других возможных неполадок см. в разд. 1.7. Помните и выполняйте следующие простые правила работы с микроскопом. Правило 7. Сфокусированное изображение должно быть хорошо освещено. Правило 2. Если света слишком много, применяют нейтральный светофильтр илн отодвигают подальше источник света. Для нммерсионных объективов, имеющих большую апертуру, важно избежать уменьшения освещаемой области опусканием конденсора или прикрыванием апертурной диафрагмы конденсора более чем на 100(с, хотя это может оказаться полезным при использовании безыммерсионных объективов с маленькой апер- 21 члсть ь моРФология турой и при просматрнвании живых неокрашенных клеток. Правило 3.
Если для объектива, который хотят использовать, света не хватает, то причина кроется либо в том, что свет чем-то заслонен, либо в том, что не подходит данная система освещения. В последнем случае следует заменить лампу или конденсор. Правило 4. Исследуемый препарат должен быть частью (почти) однородной оптической системы и залит маслом, водой нли соответствующей средой. Никаких деталей нельзя различить в высушенных окрашенных пленках бактерий, рассматриваемых с помощью безыммерсионного объектива.
Правило 5. Линзы должны быть всегда чистыми н не- запыленными, без следов пальцев, носа и туши с накрашенных ресниц. Отдельные живые бактерии, дрожжевые клетки или грибные гнфы хорошо видны даже при просмотре через дно чашки Петри с объективом 10Х. При этом природа н состояние исследуемого материала устанавливаются без каких-либо дополнительных манипуляций.
Здесь стоит сделать два следующих замечания, существенных при работе с чашками Петри: 1) лучшее освещение при обследовании чашки через дно обеспечивается использованием вогнутого зеркала и 2) искажение изображения за счет царапин на стекле или неровностей дна чашки в области, находящейся под микроскопом, можно устранить с помощью капли иммерсионного масла; каплю накрывают покровным стеклом, благодаря чему обеспечивается однородный световой путь н скрываются дефекты поверхности. 1.2, ФАЗОВО-КОНТРАСТНАЯ МИКРОСКОПИЯ Микроскоп, который собран и постоянно используется для фазово-контрастной микроскопии, следует предпочесть тому, который работает и как фазово-контрастный н как обычный 1после соответствующей замены оптики) на том же штативе.
Для фазово-контрастной микроскопии требуется много света и гораздо ббльшая оснащенность по сравнению с обычной микроскопией окрашен- 22 1 СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ ных препаратов. Для уменьшения неизбежных хроматических аберраций пользуются зеленым светофильтром. Существенным является центрирование фазовой пластинки, находящейся в конденсоре, по отношению к пластинке в задней фокальпой плоскости объектива. Центрирование достигается проецированием их обеих при помощи фокусирующего окуляра («телескопа»), и приведением к центру создаваемой ими системы колец, для чего пользуются двумя регулнровочными ручками по бокам конденсора. Одно из преимуществ фазово-контрастной микроскопии перед темнопольной, которая применяется в настоящее время реже, заключается в полном использовании апертуры объектива, что влечет за собой необходимость применения самых высококачественных фазово-контрастных объективов.
Это в свою очередь предполагает использование конденсора с достаточно большой апертурой и, так же как и раньше, применение компенсационных окуляров с увеличением 15Х или даже 20Х, способных реализовать то высокое разрешение, которое дают объективы. Вполне доступны фазово-контрастные иммерсионные объективы средней силы (40Х вЂ” 60Х), которые дают хорошо очерченные полноценные изображения при работе с мицелием грибов и другими большими клетками.
Наилучшие результаты получают, применяя объективы с увеличением 90Х и 100Х и числовой апертурой больше 1,О, используя иммерсию. Однако удовлетворительные результаты фазово-контрастная микроскопия дает и без применения иммерсии, например при подсчете бактерий, простейших и спор, проверке подвижности или при определении размера и формы.
В том случае, когда хотят увидеть детальную внутрнклеточную организацию живых организмов, следует обратить Внимание на прсломляющие свойства среды, в которой рассматриваются клетки; наилучших результатов достигают при добавлении в среду желатины до 15 — 30%. При этом показатели преломления среды и внутриклеточного содержимого становятся одинаковыми или почти одинаковыми, а фазовая задержка пропорциональна показателю преломления, умноженному на световой путь. В этих условиях уменьшаются также ореолы. йв чАсть ь моРФология 1.3. МИКРОСКОПИЯ С ВЫСОКИМ РАЗРЕШЕНИЕМ Под «исследовательским микроскопом» имеют в виду микроскоп, позволяющий выявлять тонкую дегальную структуру при большом увеличении.
Он не предназначен для оценки результатов окраски по Граму, зато он помогает разрешать вопросы, которые касаются жгутиков и другого материала, требующего выявления тонких деталей. В этих целях самое пристальное внимание следует уделить качеству оптики. Чтобы достичь высокого разрешения, а также устранить хроматические и сферические аберрации, нужно с вниманием отнестись к основополагающим принципам. Разрешение (ц) есть наименьшее расстояние между точками детали в препарате, которые еще не сливаются в изображении, видимом в микроскоп или на фотографии.
К=Л/2 (ч.а.), где А — длина волны применяемого света, а ч.а.— числовая апертура — мера светособирающей способности объектива. Для получения наименьших значений К следует применять коротковолновый свет, хотя, к сожалению, свет наиболее эффективной части спектра (а именно ультрафиолет в области 365 нм) не воспринимается глазом и не проходит через стекло. Чтобы использовать преимущества ультрафиолетового света, например в случае люминесцентной микроскопии, нужна оптика из кварца или плавикового шпата (флюорита) и необходимы непрямые методы наблюдения.
Наилучшие результаты с видимым светом получают в желто-зеленой области спектра, поскольку аберрации объективов минимизируются именно для этой области длин волн. С точки зрения разрешения эта область, однако, является сравнительно длннповолновой. Числовая апертура иммерсионного объектива обычно составляет 1,30 нли 1,32, у наилучших объективов она достигает 1,4. Она представляет собой произведение синуса половины угла между крайними лучами пучка света, входящего в объектив, иа показательпреломления среды, через которую свет проходит к объективу. Максимальное значение, которое может принимать функция синуса, не превышает 1,0, но показатель преломления среды, через которую свет проходит к объективу, можно 24 !.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
