Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 28
Текст из файла (страница 28)
18.1.3 н 22.1. 5.1.!. Продавливание с помощью пресса Продавливание с помощью пресса представляет собой, вероятно, самый распространенный и самый полезный метод разрушения клеток. Некоторое количество бактериальной суспензии (объемом 5 — 40 мл с содержанием клеток до 30 об. ' ) помещают в стальной цилиндр с плотно пригнанным поршнем, имеющим маленький выпускной клапан с узким отверстием; с клапаном соединена выводящая трубка. Цилиндр с поршнем ставят под 10-тонный гидравлический пресс. По мере того как поршень опускается, клетки разрушаются большими гидродинамическими силами, возникающими при прохождении клеточной суспензин через отверстие выпускного клапана. У этого метода есть ряд преимуществ.
Вопервых, нет проблемы с охлаждением, так как цилиндр и поршень пресса охлаждают заранее, а нагрев происходит только при прохождении клеток через отверстие клапана. Температура вытекающей жидкости повышается на 5 — 10'С, но этужидкостьможиобыстроохлаждать, если собирать в металлическую пробирку или стакан, помещенные в ледяную баню. Во-вторых, разрушение происходит практически мгновенно, и суспензия разрушенных клеток не подвергается дополнительным гидродинамическим воздействиям, которые могли бы повредить субклеточные частицы. В-третьих, при использовании гидравлического пресса удовлетворительного качества можно проводить эксперименты в хорошо вос- 140 к пОлу'1ение клетОчных 'РРАкций производимых условиях.
К тому же на степень разрушения не влияет плотность клеточной суспензии, фаза роста, в которой были собраны клетки, или среда, в которой клетки суспендированы. Установка типа пресса Френча состоит из цилиндра, поршня, выпускного клапана и подающей нагрузку станины (Ашелсап 1пз(гшпеп! Со.
1Аш!псо), Коску!!1е, М(У.). В старых моделях этого пресса использовали быстро изнашивающийся клапан со стальной иглой, который часто повреждался во время работы. Вместо него можно использовать выпускаемый сейчас клапан с подогнанным по размеру нейлоновым шариком (Апппсо). Он позволяет поршню доходить до дна цилиндра, не вызывая повреждений, и обеспечивает более однородное разрушение. Удобен также гидравлический пресс с приводом от мотора; пресс можно устанавливать на постоянное усилие в диапазоне скоростей движения поршня (Апипсо; или Епеграс, 1пс., Вп!!ег, Ж!з.).
Клеточную суспензию загружают в цилиндрическую ячейку и помещают под гидравлический пресс. Поршень пресса опускается на поршень ячейки, пока не разовьется максимальное усилие. До этого момента выпускной клапан закрыт, а затем его медленно открывают до тех пор, пока поршень не пойдет медленно вниз. Перед разрушением Е. сой клетки собирают, отмывают один раз и суспендируют в объеме буфера [0,01 м НЕРЕЯ (Х-2-гидроксиэтилпиперазии-К'-2-этансульфоновая кислота), рН 7,4 при 0'С1, составляющем 0,1 объема взятой культуры.
Добавляют немного панкреатической рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы (0,1 мг/мл) и разрушают суспеизию на прессе Френча под давлением 14 10т Па. После разрушения добавляют МпС1Р до конечной концентрации 1 мМ и удаляют неразрушившиеся клетки центрифугированием при 5000 и в течение 5 мин. Мп'Р нужен для того, чтобы функционировала дезоксирибонуклеаза; его добавляют после разрушения, чтобы предотвратить стабилизацию рибосом. Рибонуклеаза действует в отсутствие Мпз+. Можно использовать и другие буферы, например фосфатный, но трис-буфера или хелатирующих агентов следует избегать, чтобы предотвратить повреждение наружной клеточной мембраны. 141 ЧАСТЫ.
МОРФОЛОГИЯ Пресс Френча эффективен при разрушении грамотрицательных и некоторых грамположительных бактерий (особенно бацилл), Эндоспоры и грамположитсльные кокки в нем не разрушаются, для этих устойчивых кле. ток более действенно баллистическое разрушение или обработка лизоцимом. Пресс Риби сходен по принципу действия с прессом Френча; различия между ними состоят в том, что пресс Риби развивает большее давление (в нем можно разрушать эндоспоры и некоторые наиболее устойчивые клетки) и имеет систему охлаждения. Его конструкция обеспечивает безопасную работу с патогенными микроорганизмами, однако, к сожалению, этот пресс больше не выпускается.
5.1.2. Разрушение ультразвуком Для разрушения клеток применяют разнообразные ультразвуковые генераторы с вибрирующим пестиком. Высокочастотная вибрация наконечника пестика вызывает кавитацию, т. е. образование микроскопических пузырьков газа, движущихся с большой скоростью вблизи наконечника. Порождаемые этими быстро движущимися пузырьками большие гидродинамические силы приводят к разрушению клеток. Такой метод разрушения заманчив, так как подобные дезинтеграторы недороги и эффективны. Однако методу ультразвукового разрушения присуши недостатки, ограничивающие его применение в исследованиях, связанных с фракционнрованием клеточного содержвмого.
Основной недостаток заключается в том, что разрушение происходит не мгновенно; для того чтобы разрушилась достаточная доля клеток, клеточную суспеизию нужно обрабатывать в течение периода времени от 30 с до нескольких минут. В этот период высвобожденные субклеточные частицы подвергаются тем же самым большим гидродинамическим воздействием, что и неразрушенные клетки. Мембранные пузырьки деградируют до маленьких липопротеидных фрагментов, не осаждающихся при ультрацентрнфугировании, а мембранные белки заметно перераспределяются между различными мембранами (например, между внутренней и наружной мембранами у грамотрицательных бактерий).
142 к полгчвнив клвточных фглкцип Во время разрушения клеток ультразвуком довольно трудно поддерживать низкую температуру образца. При этом может происходить вспеннвание, вызывающее денатурацию белка, а кроме того, из-за кавитации может ускоряться окисление чувствительных к кислороду ферментов и ненасыщенных липидов. Трудности, связанные с образованием пены н поддержанием нужной температуры, сводятся к минимуму, если пробу подвергать не одной продолжительной, а нескольким кратковременным обработкам и охлаждать в перерывах между обработками. С проблемой окисления можно справиться, если проводить обработку пробы в атмосфере аргона.
Нельзя сказать, что рассматриваемый метод отличается хорошей воспронзводимостью, так как эффективность обработки ультразвуком зависит от вязкости пробы, а также от размера, формы и химического состава сосуда, в котором находится проба (например, в стеклянном стакане разрушение клеток проходит гораздо более эффективно, чем в пластмассовом, который поглощает часть энергии ультразвука). Предупреждение: работающие с ультразвуком должны надевать на уши защитные приспособления, если только обработку не проводят в звукопоглощающем боксе.
Ультразвуковая обработка не очень хороша для первичного разрушения клеток, однако она эффективна для лизировання сферопластов (что осуществляется в методике разделения наружной н внутренней мембран грамотрицательных бактерий по Осборну и Мунсону (8)) как способ разбивания комков из внутриклеточных органелл н для суспенднровання отцентрифугированных осадков.
Для этих целей достаточны очень короткие ультразвуковые обработки, в процессе которых внутрнклеточные органеллы не повреждаются. 5.1.3. Баллистическое разрушение Термином «баллистическое разрушение» обозначают разнообразный набор методов, в которых бактерии разрушаются силами сдвига, развивающимися, когда суспензия клеток очень сильно встряхивается или перемешивается вместе с маленькими стеклянными или пластмассовыми шариками. Для этого промышленностью 143 ЧАСТЬ Ь МОРФОЛОГИЯ выпускается множество устройств, которые очень детально описаны в обзорах Сэлтона 110) и Хьюджеса с соавторами !4). В ранних работах широко применялись два устройства — аппарат Мнкля для встряхивания и аппарат для встряхивания, насаживаемый на ось центрифуги типа 1п1егпайопа! 114]. Ни в одном из них не обеспечивалось поддержание низкой температуры во время встряхивания, и поэтому приходилось часто прерывать процесс для охлаждения пробы.
Эти устройства больше не выпускаются промышленностью, они заменены тканевым дезинтегратором Брауна (Вганп МБК; В. Вганп Ме!зпппеп Аррага1еЬап, Ме!зиппеп, Резега! ЯериЫ!с о1 Оегшапу), который поставляется в США многими фирмами, специализирующимися на выпуске лабораторного оборудования. Дезинтегратор Брауна имеет контейнер для пробы объемом 65 мл, который качается в горизонтальной плоскости счастотой 2000 — 4000колебаний/мин. Охлаждение обеспечивается струей жидкого СОМ направляемой к контейнеру с пробой.
В большинстве случаев клетки разрушаются за 3 — 5 мин прн температуре ниже 4'С. Дезинтегратор Брауна применяют, если требуется выделить клеточные стенки и отдельные ферменты из грамположительных бактерий. Как правило, прн этом пользуются методикой Ворка !141. Суспензию клеток (30 мл с содержанием сухого вещества 20 — 50 мг/мл) в подходящем буфере сме1пнвают с 20 мл шариков ВаПоВп1 № 12 в соответствующем контейнере (для воздуха важно оставить не меньше 20% объема емкости) и в течение 0,5 мин для охлаждения контейнера через аппарат пропускают СОЬ Затем в течение 3,5 — 5 мин в зависимости от типа клеток пробу встряхивают с частотой 3000 движений в минуту. Шарики удаляют низкоскоростным центрифугированием или пропусканием смеси через грубый стеклянный фильтр.
Некоторые исследователи предпочитают использовать вместо стеклянных шариков пластмассовые, как описано Россом !91, чтобы свести к минимуму денатурацню ферментов. Если описанную выше методику применяют для выделения клеточных стенок„то пробу после встряхивания немедленно подвергают обработке, обеспечи- 144 к полгчвнив клвточных эплкцип вающей ииактивацию автолитических ферментов 114).
Эндоспоры бактерий разрушают в дезинтеграторе Брауна при встряхивании сухих спор с сухими шариками (5 г сухих спор плюс 15 г шариков), как описано выше, и затем суспендируют их в буфере, как описано Стейнбергом (12]. 5.1.4. Измельчение в твердом состоянии Клетки можно разрушить размалываиием концентрированной биомассы или лиофилизованиых клеток абразивами, такими, как коруид, или измельчеиием в твердом состоянии, которое достигается при продавливании замороженной суспензии или биомассы через маленькое отверстие или щель.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
