Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 30
Текст из файла (страница 30)
Поскольку растворы сахаровы относительно вязкие, градиенты, как правило, формируют заранее. У растворов хлористого цезия вязкость низкая, так что трудно заранее приготовить его градиентный раствор; в этом случае применяют технику изопикнического центрифугирования в градиенте плотности. Пробу смешивают с хлористым цезием в количестве, достаточном для создания плотности, равной средней плотности субклеточных частиц. Эту гомогенную смесь помещают в сосуд для центрифугирования, и в результате седиментации хлористого цезия в поле центробежных сил при центрнфугировании формируется его градиент. Поскольку скорость седиментации частицы постепенно снижается по мере достижения ею той области градиента, где она имеет плотность одинаковую с плотностью раствора, для достижения равновесия центрифугировать требуется очень долго.
Это особенно важно для маленьких мембранных везикул, таких, как хроматофоры, или для фрагментов цитоплазматическнх мембран клеток, разрушенных на прессе френча, так как скорость седиментации этих частиц низка даже в отсутствие градиента. Если применять центробежные ускорения порядка 100000 — 200000 и, для более или менее хорошего разделения требуется пе меньше 24 ч, а для полного — 72 ч. 5.2.4.
Градиенты сахарозы Концентрация сахарозы в растворах для приготовления градиентов указывается в литературе по-разному: в единицах плотности, в молях сахарозы, в весовых про- 150 з. полгчвнив клеточных еглкцнн центах сахарозы (вес/вес), в процентах на единицу объема (вес/объем илн г/100 мл). В стандартных химических справочниках есть таблицы для перевода концентраций водных растворов сахарозы нз одних единиц в другие. Чаше всего используются весовые проценты сахарозы. При приготовлении сахарозных растворов плотность воды илн разбавленных буферов принимают равной 1 г/мл.
Следовательно, чтобы приготовить, например, раствор 54% -ной (вес/вес) сахаровы, нугкно растворить 54 г сахарозы в 46 мл воды. При этом образуется 100 г раствора, а поскольку плотность 54%-ного (вес/вес) раствора сахарозы равна 1,2451, конечный объем будет 80,3 мл. Приготовление растворов таким путем устраняет необходимость доведения вязких растворов до фиксированных величин объема. Для создания градиентов промышленностью выпускаются разнообразные устройства, но нх применение не обязательно, так как удовлетворительные по качеству градиенты можно приготовить, наслоив друг на друга в центрифужном стакане ряд сахарозных растворов и выдержав в течение ночи, чтобы за счет диффузии образовался непрерывный градиент. Нет необходимости выдерживать градиенты, которые будут центрифугироваться 24 ч и больше, так как за время центрифугирования благодаря диффузии сформируется непрерывный градиент.
Мы обычно готовим градиенты из пяти-семи слоев. Когда используются смачиваемые центрифужные стаканы, например, из нитроцеллюлозы или поликарбоната, слои можно наносить, давая им стекать вниз по стенке стакана из пипетки, которую держат под углом к стенке. Если берут несмачиваемые стаканы, такие, как полналломерные илн полнпропиленовые, то кончик пипетки прн добавлении раствора должен находиться в контакте с мениском, чтобы не происходило персмешивания.
Самый простой метод отбора фракций из сахарозных градиентов заключается в их выкачивании с помощью перистальтического насоса. Центрифужный стакан зажимают в круглых лапках (мы применяем кусок прозрачного плекса с просверленным по диаметру стакана отверстием, который зажимаем в лапках), а над ним в круглых лапках закрепляют трубочку небольшого ЧАСТЬ !. МОРФОЛОГИЯ диаметра нз нержавеющей стали. Трубочку подсоединяют к насосу и опускают в стакан до соприкосновения с дном. Затем градиентный столбик с помощью насоса раскапывают по находящимся в коллекторе фракций мерным пробиркам.
5.2.5. Детергенты Детергенты применяются при фракционированни клеток в трех случаях. Когда хотят получить немембранные органеллы, такие, как рибосомы, нуклеоиды и т. д., детергенты обеспечивают мягкое лизирование клеток после нарушения целостности муреина (грамположительные бактерии) или наружной мембраны !Грамотрицательпые бактерии).Детергенты применяют также для того, чтобы избирательно перевести в раствор цитоплазматическую мембрану грамотрицательных бактерий, сохранив интактной наружную мембрану, или удалить мембранные загрязнения с рибосом, полисом и стенок грамположительных клеток. Детергенты представляют собой амфипатические молекулы, т. е.
молекулы, имеющие как гндрофильную, так и гидрофобную области; они умеренно растворяются в воде. В очень низких концентрациях дстергенты образуют в воде истинный раствор. По мере возрастания концентрации молекулы детергента агрегпруют с образованием мицелл, в каждой из которых гидрофильные области обращены к воде, а гидрофобные скрыты от воды внутри мицеллы.
Концентрацию, при которой по мере добавления детергента к воде начинают образовываться мицеллы, называют критической концентрацией мицеллообразования (ККМ). Каждый детергент характеризуется своими ККМ, размерами и формой мицелл. Превосходный обзор Хелениуса н Симонса )31 суммирует свойства многих детергентов, применяемых для получения клеточных фракций. Детергеиты можно подразделить на три класса, различающиеся по свойствам мицелл, способности связываться с белками и способности взаимодействовать с другими растворенными веществами. К этим классам относятся ионные детергенты, ненонпые детергенты и со- !52 6 ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИИ ли желчных кислот. С каждым детергентом связаны свои трудности и свои преимущества при фракционировании клеток.
Ионные детергенты К самым распространенным ионным детергентам относятся додецилсульфат натрия (лаурилсульфат натрия, ДСН), 11-лаурилсаркозинат натрия (саркозил), алкилбензосульфонаты (обычные, применяемые в домашнем хозяйстве детергенты) и соли четвертичных аминов, такие, как бромид цетилтриметиламмония (цетавлон).
Ионные детергенты склонны образовывать небольшие мицеллы (с мол, массой -10000) и имеют относительно высокую ККМ (для ДСН ККМ при комнатной температуре в разведенных буферах составляет примерно 0,2%). На ККМ и растворимость ионных детергентов сильно влияют ионная сила раствора и природа присутствующих в нем противоионов. К примеру, 10%-ный раствор ДСН теряет стабильность при температуре около 17'С, в то время как сходный раствор додецилсульфата в трисе стабилен при 0'С. Додецилсульфат калия растворим только при повышенных температурах, и поэтому при использовании этого детергента К' следует исключать из всех буферов. Такие детергенты, как ДСН, которые имеют сильно ионизированную гидрофильную группу, не подвержены влиянию изменения реакции среды в широком диапазоне рН и не осаждаются 5%-ной трихлоруксусной кислотой.
Ионные детергенты сильно связываются с белками, и в случае ДСН обычно происходит разворачивание и необратимая денатурация белковых молекул. Хотя ионные детергснты можно удалить диализом, как правило, этого не делают нз-за значительного связывания их с белками. Неионные детергенты К неионным детергентам относятся тритон Х-100, нонидет Р-40 (1ЧР-40), твин 80 и октилглюкозид.
Обычно мицеллы этих детергентов обладают большой молекулярной массой (50000 и больше) и низкой ККМ 153 ЧАСТЬ ! МОРФО ЧОГИЯ (0,1то и ниже), что ограничивает их применимость при гель-фильтрации или гель-электрофорезе. На свойства этих детергентов в растворе почти не влияют реакция среды н ионная сила, хотя онн могут осагкдаться 5Ъ-ной трихлоруксусной кислотой.
Неионные детергенты связываются только с гндрофобными белками и, как правило, не вызывают денатурацни или потери биологической активности. Сола желчных кислот Соли желчных кислот представляют собой соли стернновых производных, например холат, дезоксихолат илн таурохолат натрия. Из-за того что массивные стериновые ядра плохо упаковываются, эти детергенты образуют небольшие мицеллы (часто всего из нескольких молекул), а молекулярная масса последних в отличие от других детергентов является функцией концентрации детергента. Поскольку эти детергенты — соли очень плохо растворимых кислот со значениями рК, в области 6,5 — 7,5, их следует использовать в щелочных диапазонах значений рН.
Чтобы избежать трудностей с растворением, применяют концентрированные исходные растворы, которые готовят, растворяя в избытке НаОН соответствующую свободную кислоту. При работе с этими детергентами ионный состав, значение рН и общая концентрация детергента должны поддерживаться на постоянном уровне. Проблемы, возникающие при использовании детереентов Поскольку большинство детергентов используется в концентрациях, довольно сильно превосходящих ККМ, и поскольку действие детергентов обусловлено образованием смешанных мицелл с липидами или связыванием с белками, отношения детергент: белок илн детергент:липид значительно важнее истинной концентрации детергента.
Как правило, достаточный избыток детергента обеспечивается при соотношении 2 — 4 мг детергента к 1 мг белка. Например, если для солюбилизации мембран используется 2е(о-ный тритон Х-100, концентрация белка в пробе должна быть не больше 5 — 10 мг/мл. 154 б ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИП Тритон Х-100, один из самых ценных неионных детергентов, создает трудности прн измерениях количества белка, поскольку он содержит ароматический остаток, препятствующий измерению поглощения при 280 им, а в пробах с участием химических реагентов образует мутный осадок.
Мы обычно преодолеваем эту трудность с помощью мечения культуры небольшим количеством 'Н-лейцнна. Если метка вводится в минимальную или синтетическую солевую среду, следует позаботиться о том, чтобы добавить туда достаточное количество немечсного лейцина, обеспечив тем самым постоянное в течение всего периода роста включение изотопа из расчета на 1 мг белка. Для Е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
