Методы общей бактериологии (том 1) (947292), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Практически все препараты и оборудование, необходимое для работы с анаэробной системой модели У. Р.1., поставляет фирма ВеПсо О!азз, 1пс., У!пе!апб, Ь!. 3. Несмотря на очень подробное описание некоторых модификаций метода Хангейта, им довольно трудно овладеть.
Лучше всего посетить для этого лабораторию, где этот метод применяется. Ниже приводятся только основные этапы и наиболее простые приемы, используемые в методе Хангейта. Удаление кислорода из газов Из газов, используемых для замещения воздуха, следует удалить кислород с помощью одного из следующих приемов.
1. Пропускают газ через колонку нли сушильную печь, нагретую до 350'С и содержащую медь [61. Медь чернеет после ее полного окисления. Для регенерации меди в восстановленную форму ее выдерживают в атмосфере, содержащей не менее 3!)Ь Нь (Преду!!реждение: пока в колонке остается примесь Оь не пользуйтесь чистым Нм так как не исключена опасность взрыва.) 2.
Газ с Ззь-ным содержанием Нз пропускают через очиститель модели Пеохо (Марйезоп Яс!еп!!1!с, 1пс., Ки1- Ьег1огб, 1ч. Л.). 3. Газ пропускают через специальную склянку с раствором титана(П1)-цитрата (см. табл. 6.6). Когда раствор полностью окисляется, т. е. становится бесцветным, его заменяют. 6. БиоФизическиа ФАктОРы Рнс. 6.2. Газовый зонд (канюля), применяемый по методике Хангейта. В зксперименте используют не менее двух зондов. После сборки зонды автоклавируют, чтобы простерилизовать вату, а затем в пламени горелки стерилнзуют иглу.
Скорость потока СОз илн другого не содержащего кислород газа (не более зей Нз) регулируют, направляя его на пламя бунзеновской горелки. Струя газа должна вызывать ви. днмое отклонение пламени, Открытые пробирки или колбы необходимо постоянно продувать газом 1 — заполненный ватой цилиндр шприца типа 1пег-1.ос емкостью 2 см', 2 — резиновая трубка с внутренним диаметром 0,63 см; 3 — газ без примесей Оз, поступающий из коллектора; 4 — 6-дюймовая игла № 18; 5 — спиленный острый конец иглы; б — фланец цилиндра шприца.
Приготовление предварительно восстановленных сред В круглодонную колбу помещают устойчивые к нагреванию компоненты среды (за исключением восстанавливающего агента), добавляют предварительно простерилизованные кипячением кусочки стекла и осторожно кипятят раствор, пропуская над его поверхностью струю газа, лишенного кислорода. Газ продолжают пропускать н во время остывания среды, и при ее разливе.
В зависимости от вида среды и культивируемого анаэроба используют двуокись углерода или аргон с добавленяым к ним Нз (Зо(а). Применяют газовый зонд, показанный на рис. 6.2. Когда среду необходимо использовать вскоре после автоклавирования, к ней сразу же добавляют восстанавливающий агент, если он устойчив к нагреванию. Если же восстанавливающий 189 ЧАСТЬ П. РОСТ агент не обладает этим качеством, то его вносят в среду непосредственно перед инокуляцией.
Среду разливают по пробиркам или флаконам, снабженным пробками из черной резины (лучше всего бутиловой), соблюдая следующие предосторожности. 1. Во время разлива среды над ее поверхностью постоянно пропускают струю бескислород~ого газа, причем пробирки или флаконы, в которые разливают среду, также следует предварительно продувать газом. 2. Предварительяо заполняют газом пипетку, используемую для внесения среды. Эту пипетку оснащают грушей или резиновой выходной трубкой. Не следует набирать газ или жидкость в пипетку быстрее, чем газ поступает в сосуд. 3.
После разлива среды пробирку или флакон закрывают пробкой таким образом, чтобы в иих не попал воздух. Эта крайне важная операция требует определенного навыка. Для этого пробку держат у входного отверстия пробирки, продолжая пропускать газ еще в течение нескольких секунд, а затем быстро вынимают из пробирки газовый зонд и одновременно закрывают пробкой, фиксируя ее вращательными движениями. Согласно другому способу, флакон со средой, лишенной кислорода, можно закрыть пробкой из бутиловой резины, как описано выше. Пробку закрепляют зажимом или проволокой, затем среду автоклавнруют 1211 и раз.ливают по пробиркам с соблюдением правил асептики. Однако при использовании этого способа увеличивается опасность загрязнения стерильной среды и не исключается попадание в нее следов кислорода. Для стерилизации пробки в пробирках нли флаконах должны быть закреплены с помощью зажимов.
Существует специальный пресс для удерживания в фиксированном положении целого набора культуральных пробирок с пробками, поставляемый фирмой ВеПсо 61азз, 1пс. Зажимы для отдельных пробирок можно изготовить самим из вешалки для одежды [171. В специальных пробнрках Хангейта, снабженных завинчивающимися крышками с отверстием диаметром 9 мм (ВеПсо О(азз, 1пс., Л$2947), резиновые пробки с бортиками не нуждаются в зажимах. Используют также пробирки или сосуды с горлышком, как у флаконов для сывороток, осна- 190 к виОФизический Флктоеы шенные перегородчатыми пробками из бутиловой резины 129!. Пробки можно закреплять с помощью алюминиевых крышек (%йеа1оп 5с1еп1111с, М111ч111е, Х.,).).
Инокуляция и пересев При использовании пробирок Хангейта [6) или пробирок и бутылей с горлышком, как у флаконов для сывороток 1291, инокуляцию культуры и ее пересев можно производить с помощью обычных шприцов для подкожных инъекций. Предварительно через шприц несколько раз пропускают газ, не содержащий кислорода. Среды в пробирках, оснашенных хорошо подогнанными резиновыми пробками, инокулируют следующим образом: быстрым движением немного вынимают пробку и в образовавшееся отверстие вставляют стерильную газовую канюлю, добавляют инокулят, вынимают канюлю и затем пробирку вновь закрывают пробкой. Образцы или культура, из которой отбирают инокулят, должны также обдуваться струей газа и находиться рядом с пробиркой, в которую переносят инокулят.
Серологическую нли пастеровскую пипетку, используемую для пересева, предварительно заполняют стерильным газом. Пересев производят также с помощью стальной или платиновой петли. Для быстрой инокуляции различных сред одной культурой очень удобна система для выращивания анаэробных культур У.Р.1.
(Ве!!со О)азз, 1пс.). Вращающиеся пробирки Для выделения отдельных колоний строгих анаэробов и для подсчета жизнеспособных клеток используют вращающиеся пробирки, которые удобнее, чем чашки Петри. Готовят агаровую среду, как описано выше, и разливают ее по пробиркам. Охлаждают расплавленный агар до 45'С в пробирках с пробками и зажимами. Если пробирки со средой приготовлены заранее, перед кипячением необходимо убедиться в том, что они снабжены зажимами. Неразведенные пробы и пробы, разведенные предварительно восстановленной средой (или раствором), переносят в пробирки, как описано выше, смешивают со средой (при этом следят за тем, 191 чхсть и.
гост чтобы не образовалась пена) и затем вращают пробирку под струей холодной воды, пока агар не застынет. Стараются, чтобы агар равномерно покрыл стенки пробирки. Механическое устройство, облегчающее эту процедуру 151, поставляется фирмой Ве!1со О!азз, 1пс. Вращающиеся пробирки можно засевать штрихом с помощью специальной петли или шпателя, начиная со дна пробирки и затем постепенно продвигая петлю вверх, одновременно вращая пробирку и продувая ее газом с помощью газовой канюли (разд.
8«Ь!). Фирма Вейсо О(азз, 1пс. производит устройство для вращения пробирок во время посева культуры штрихом. 6.6.5. Анаэробиые камеры для строгих анаэробов (анаэростаты) Арапка и др. 119] и Арапка и Фритер [181 описали изготовленную из гибкой пластмассы камеру, оснащенную специальным устройством с перчатками, в которой выращивают анаэробные бактерии столь же эффективно, как п во вращающихся пробирках.
Эта камера, известная как «анаэробная камера Фритера>, была испытана и используется во многих лабораториях. Она пригодна для работы даже с очень чувствительными метанобразующими бактериями 1201. Ряд подобных камер поставляется различными фирмами (иапрнмер, Соу ЕаЬога1огу Ргобпс(з, 1пс., Апп АгЬог, М1сЬ.), Среди главных преимуществ таких камер следует отметить то, что они позволяют использовать стандартные бактериологические методы, включая посев культуры в чашках, перенос колоний с помощью реплик и определение чувствительности к антибиотикам. Кроме того, они позволяют приготовить любую необходимую среду, а для работы с ними не требуется особого навыка. Однако для этих дорогостоящих камер нужно специальное помещение; кроме того, возникает ряд неудобств при работе в перчатках и с предварительно приготовленными средами.
Совместное использование метода Хангейта и хорошо функционирующей анаэробной камеры позволяет проводить практически все виды экспериментов с большинством строгих анаэробов. Ниже мы остановимся на В. БиоФизичвскив Флктогы условиях работы с аиаэробными камерами и укажем на основиые предосторожности, о которых необходимо помнить. 1. Существуют камеры, которые можио использовать так же, как термостаты. При температуре в камере от 30 до 37'С руки нагреваются и потеют, и бывает трудно снять с иих перчатки. Поэтому при работе в камере даже при комнатной температуре в течение долгого времени лучше иадеть вначале нейлоновые перчатки, а сверху резиновые. Во многих случаях предпочтительнее иметь небольшой термостат внутри камеры.
Можио также чашки Петри с засеяиной средой или другие емкости поместить в специальные сосуды, закрыть их и удалить из камеры для последующей инкубации. 2. Используемая в камере газовая смесь должна содержать 1О'/э водорода.
Наиболее часто используемые смеси содержат азот с 5'/э СО; — !0% Н~ или азот с !07с Нь Если в процессе работы с бактериями необходим СО,, то следует обеспечить его бесперебойиую подачу. Газовые смеси поставляются фирмой Марпезоп 3с!еп1!!!с, ио они довольно дороги. Эта же фирма производит газосмеситель, который очень полезен в работе. 3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
