1625915648-5ed1152c004edfe493dad6e5388afaf3 (843956), страница 89
Текст из файла (страница 89)
11р(имунис)тк> описанного л!стада очсиилно: измеряетгя ток, прогсклоии!й только чсрсз тот участок мсмбрщиж лля которого ззвсломо вьшол няется и рост раисп>си нос ус >ювис фиксации пои нциала. Ислостзток мстола ззклк>чается в трудности замены наружного рас гвора в лвусп>ольиой микроиипеткс. Тем пс менее, его ищк>льзование позволило получить ряд важных результатов. Оказалось.
что ионньн' токи нервных клеток лачес'и!с!Нн> схозны (' ионными токами аксона. Исхлеяо!Ганна метолоч фиксации и(псициалз были выиолнснь! Нз изолированных клегках рз.ыичиых ткзисй. ИЗОлириВ ни(зя клстка пр(лстзиляс! ГОООЙ экнииотсициальну!о с()>ору и и( требует л(нншиительных устройств Для ОсущсстВлснпя эт010 л!с!Олз и('ПОль;>ОВ;>ли элеюгроино-излнрительиу)о схему, привет!Снилх> на рис.
19).1, и лва микро>лслтрола, вшлсиных в олпу кл(пку. Мсмбраш!ый потсишщл регист)и!ру('Гся микр(юле!пролом и !П>лается иа )силн)ель !аиряжгиия. С иомощьк»:л(>ктрониой сх(мь! с (х>ратной Гвязьн> его можно ллитцчьш>с время фш(сировап (или иоцлгрживать) иа любом уроши иутгм иропускаиия тока через второй микроэл( ктрол, Поэтому:>тот иотси ! !иал такжг >щзь(ванна ио>ь(срживасмыл! (!и>!(!П))> ро((п((з!).
При иом(яци генератора ирямоу! ольиь!х импульсов элсктриюского тока из ли мбранс ио>т>((рл(ииаемы!! (ютенци(и м(>жнО (м(>цать ло и( к(>!000й (п)ВОП Вс!инины п ул(рживзть иа,>том уровне также г яол!Ои(ьк>:»и к()хпи!о!! схемы с обрз(ной связью. Ток, проц какиций н рсз этот участок ли>морзиы ири Поппер>ливасмом иоты(пиале 10 МОм Уонпнтепь, ннвертнрующ сигнал н подающнн его на клетку ежуточный нтепь дпя о внешним ФЕ' - РАЗДЕЛ 11. Общая физиология возбудимых тканеи Рно. 15 1 Блок-схема установки дпя исследования кпеткак (например, нервных) методом фиксации потенциала с двумя мнкроэпектродамн Токовын мнкроэпектрод акра< <нрован (по Коэ|уих Р.О Кгюша! О А., Оогоэиепхо Р А.
Са!св<п сиггеп|э <п впа!! пеигопв 1. 1иепв(>савоп о! па|ив<о евген<э. 1924 Ее<од. Х Рьузю!. 348, 83 — 93) или под влиянием ирило)кешюго напряжения, изл|ерякю от>1сльиь>м усилителем. Пзибо.тсе сущсствщшьш ис;!остаток микро:щсктродного метода исследования нервных клеток ззклк)- Чзетеи В ОГРЗИИЧ< НИИ 6ЫСПК)ЛСйегв)ИИ СИ<)СЛ<Ь) фИК.
сзции иотснцизлз. Эта методика применительно к к.иткзм имела сущсствгииьи ограиичсиия, закзючзющигся н том, по изучать в.иыииг различных гослииеиий из ионные токи л|ожио бьшо только со стороны иаружиой по|и рхишпи м(мйрзиы. Бспи у аксона аксоилззму мож<ш было выманить как зуби)ю пасту ил тк>йик $ и .шмгии и <щ иовый рщ твор, то и и видно, 3<отакук> мз>ишузяцшос к>иткзл|и продел;пь исв<мможно. В этой гнали о> ромным и<агом яиерсл было открытие в 1!)76 г.
п Советском С(ехн в Пнс>итутс физио)оп<и им. Л.Л. Богомольца (Кисе) )и>л руковолсп)ом зкзлсмию) Л)1 С ССР П. Г, Костюка метода Внутриклсто шо|о Лиализз. Этот мсп>Л иолволял <иущсствлять ПОЛНУЮ ЗЗМСИУ ВНУтРИКЛСтОЧНОй СРСЛЫ В Иьи>ЛИРОНЗИ- иых клетках. Эксисримситальиая камера иосрслствол< воли,>ти.кчи)ной и< регоролки делилась из лва отсека (рис. ! 5.21. В иере<ори !ке с иомощьк> иглы проспер.
шВали коиичсск<х о>в<.р<-гие, соответшъукнцее ио размерпм илучзгмой к. И>|кс. С|с<и(и поры покрывали гиецизльиым составом, к которол<у ирш .и ивалзсь полне|и иная микр<иши<ткой к и гкз Релко< г<ыд)ши< в иижигм отсеке отрицатель<<оп> лщ)лещ<я разрывало часть мембраны, иахолящуккя с.лой сторонь|. 13<хил! обрззол(, с одной стороны исрсгор<щки излолилзсь внешняя шсть лимйраиы, з с другой внутренняя. Каждый отсек им<л звтоиомнух> сисп му оерфузии и электронно-измерите тьнук> < хсму 1Рормзчьиая;>лск<рическзя як|пои<к ть подобной (к ветки» мо< лз 1|оллсрживз>ься несколько часов.
что иолволя.и> илучзть потенциалы и гоко и рплличиь<х риты>рзх как <. висшн<й, так и с ниутрсииси стороны мембраны. )йозлнсе в этом жс он< ) игу и йы;щ рзлрзботзиз иро- ППЫ В ИЛ| ОТОВЛСИИ!3 И ЧЗП< ИКОНЗЯ Л<ИКРОИИИЕТКЗ ( ОТВ< рс П1ем 3 $) Й)и)п) 3)и3>л|гз р 1 н|$ В< В<и и ос для в<) три к>|си> ии>го лизлизз. В результате окзлывзкпся готовь)ми как от верстие <и>двелеии я клетки.
так и контур |и рфу.<ии иску('ствгниого Виутрик.'и.'точ1к>го рзст1>орз: исрфулирукнций клетку изнутри раствор<юла<'и я и одно колено микроииистки. а Выволится в лругос. Присасывание к клетке <ютществля< т<я благодаря отрицательному гидр(кт1<т>1ческому лзвлсник> в пни<"и'с по о>пн>иииик> к сред<. в которой находятся клетки. 11а рис. 15З л( монстрируется схел<а эксперимента оо л$31лизу в его новой конфигурации. <Эиисзннзя коигтрукция микроиии< тки оказалась и!<столько улойшой, что из се основе йыл разработан основной комплекс ла.>ыи>й<иих мо.
лификзций метода ш<утрикл<точиого Анализа. Оливки <юллинньш расцвет исслгловаиий мембран к>пток лзл так называемый мс)юл рз(с!3-с)$<и)р. Этот крзйис сложный в тс голы ли тол ир<>ьчожили в 19761. з Уснпнтепь фиксации потенциала о ре|упнруемым 100 мкм коэффициентом усиления Рнс. 15 2. Установка дг<я внутрнкпеточного днапнэа н фиксации потенциала, (а) Блок. схема метода (б) Днэпнзнрующэя пора Размеры поры показаны применительно к гигантским нейронам моллюсков (по Костюк П Г, Крыштапь О А Механизмы эпектрн. ческон возбудимости перепоя клетки М.
Наука. 1981) ГЛАВА 15. Исследован Входной уанлитель Усилитель тока зт;-4 М „>10 Гоы 100 МОМ Диаметр клетки от 10 да 20 мкм Диаметр клетки- 20 ынм Бьюгрый ионнын обмен Утечка Сс<аержимага мнкрозлектрода Рна. 1б 3. Моди<)мкацня метала внутриклеточнога диализа (ло Коыуак Р. О, Коз|та! О.А., Р<барз<олко Ч.
!., <>еьвзатьку М. Я !Ол еаггелс~п б>е леьгоыаьгатз сег) тетбгеле 197В. Лзеагоьоелае 3, 32! — 332) Э.Нсср и В).Сань<<и< (В.В>з)сл)зил). В що <кноне лежи Вринцни исщ>едоваиня клеток методом диализа с рялом тсхничггких модификаций. Ошшко уже в 108! г. Восле публикаций О. Н, Хемилз!з (О. Р. НаииИ) и соавторов зт<л л<стол лрсврзтилс я в об)33<сдостуц<<ый, <нино. ляннций ириводить любые измер<.ния из клп<ичном у)х)В<<с.
В <щстс)я1цее Время Вс<.' злск>раф1щнолОГН !<'- скис исследования мембран к.четок ироволзптя им. На .>том мстодс мы останонилкя более подробно. 1$.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ИОННЫХ ТОКОВ У ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК МЕТОДОМ РАТСН-С1 АМР Метод расс!)-с!аи)р иозноляст рс гисцицх>вать на <ыолировзнныл клетках их иотсицналы, токи илн одиночные и<>нные лзизлы иосредстном сш цизльной стекляниО<3 ии<1етки (рз<с)) .33311!с'1 к<1), НЗНОл!Нзззнн<1ей ли<3<розлсктроз<, иа имсм<цсй соирогивлгнш. от 2 до 10 МОМ в:щвисимости от гн<щ исслелусмьы клеток. Кроме того, метод иозвозыст )хтистриронать иоииьи каналы г и:нщиравзниы О кугочкз мембраны, которь<и ия ллазматнческой мембраны клеток методом ра1ОШС!атр мож<) бытьрасиоложси иоопинисиин) лотвсрстиюиии<п<н либо вы <иней, либо внутренней с<ороиой.
На риг. 15.4 наказаны микрозлснтрод и рапи-3<н1<сткз и иролгмо>н гр<цх>наны их асзн>виыс отличия. Мь! лини огмсп>м рял иолож<псльньо, момснтов ирн оримснснии зтого мсяода ио граниснин) с кл;<ссн. чщ кил> м<яозом фикгзции 1!Отс <и<3<вяз. Во-иервых, мсп>д рагсй-с)щлр и<мни.ы<я изучзп мслкис кл<ткн без сущсспзеииого иоврсждсиня их мсмбрзи, тогда кзк лаже один микрозлс к гроз, а тем более двз, сущсств<н<ю <кнзрсждазот мембрану. Во-вторых, сопротивление утечки «микрозлсктрод мсмбранаь нс ирсвыцщгт 500 МОМ, а ири исиользонзнии метода рассй-с!алц> и, соответственно, расс й-инигтки — более 10 ГОМ, что существенно <щияст нз ка и ство регистрации.
В-третьих, мнкрозлектралы имени' гаиротивлеиие, достнга<още< 100 МОМ, з ра<СЬ-из<нет><33 от 2 до 10 ЫОМ, что <и)зволяет нс только кзчсгтвсиио репи трировать потенциалы и токи клетки, <н> и вводить в клигки без особых ироблс м лк)бьи с<>единения. )У! ы ис будем останавливаться на техничсской сторон< лктода, иогкольку <>то обязало бы нас достаточно ОО)3ы<н)е Вннмзннс удел!! !'3;)лс'>ГГ)х)<<но-<кзл<сричгз!ьной зии ц)зту)х' и кОМ1<ьк)тср3<Ому 3<РОГрзл1мнрОВзнн<О, ч ГО 51ВНО <И" ВХОДЯ' !' В ИЗШИ ЗЗДЗЧИ.
Нз рнг. 1.)..> Н<>нззщ<ы рззлнчиьн конфигурации расс)3-с!Зн>р по Отнощсинн> к кл< тке илн фрагли нту ес мсмбраны. Оин образу<отса щ<сцифичсским образом, из!к>жен3<ь<м и!оке. (Нри из10ж<з<и>1 т< кста мы сОхрзныли а><глийску<о тсрминологин>. На нащ нз>.>ыд, это оиравдзиио, так как ш рещ>л < оотнстгтнуннцих и рминов слишком гр<жшздок. Кроме того, все иоследши п>лы такая тсрминолопы широко исиользустся в спечсствсниой научнс>й иериодической исчзчи.) Сначала пипетку иалнодят вилогиук> к мсмбрз<и' иж>лированиой клетки (рнс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
