1625914757-8aba282c54d2a3a371a92e361d6fe93d (843812), страница 10

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 10)

81). Ее спектрофотометрическое определение при 412 нм позволяетдостаточно точно оценить количество свободных групп.Рис. 81. Реакция с реагентом ЭллманаПолное количество остатков цистеина в молекуле белка известно поданным аминокислотного анализа, по разнице этих значений определяется67количество связанных остатков цистеина. Их положение определяется методом диагонального электрофореза на бумаге.Ферментативный (например, триптический) гидролизат белка разделяют электрофорезом на бумаге, а затем обрабатывают парами надмуравьиной кислоты:Рис. 82. Разрушение лисульфидных мостиков надмуравьиной кислотойВ результате превращения остатков цистина в остатки цистеиновой кислоты пептиды, содержавшие мостики, приобретают дополнительный отрицательный заряд и при проведении повторного электрофореза в перпендикулярном направлении обнаруживаются в стороне от диагонали(рис.

83).Рис. 83. Электрофореграмма разделения пептидов после обработки надмуравьиной кислотойI.2.3.2. Масс-спектрометрическое секвенирование белковВ последнее время все большее распространение получает массспектрометрическое секвенирование белков, отличающееся чрезвычайновысокой чувствительностью. Стратегия масс-спектрометрического секвенирования в целом сходна со стратегией секвенирования по методу Эдмана и предполагает гидролиз исходного полипептида для получения наборапептидов, которые в дальнейшем подвергаются секвенированию. Однакосамо секвенирование проводится не путем последовательного отщепления68и модификации аминокислот, а при помощи масс-спектрометра – прибора,позволяющего определять молекулярные массы веществ.При масс-спектрометрии исследуемое вещество подвергают ионизациии полученные ионы разделяют в электрическом поле в вакууме.

Для исследования белков обычно используют методы ионизации, которые даютположительно заряженные ионы. Например, в одном из таких методов,MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization), исследуемое веществосмешивают со специальным носителем (например, 3,5-диметокси-4гидроксикоричной кислотой), который способен служить донором протонов и сильно поглощает в УФ-диапазоне. Смесь облучают лазером, чтоприводит к ионизации носителя, который затем переносит часть заряда наисследуемое вещество; обычно при этом образуется молекулярный ион[M+H]+ с одним добавленным протоном. Под влиянием лазерного излучения происходит также испарение молекулярных ионов с поверхности анализируемого образца.

Далее в камере масс-спектрометра происходит разделение ионов по отношению массы к заряду, M/z.Рис. 84. Теоретический масс-спектр y- и b-ионов при секвенировании пептида с последовательностью Arg–Glu–Ala–Leu–Met–Ala–Asp–Arg–Ile–AspЕсли необходима идентификация белка с уже известной последовательностью, то часто отдельные пептиды не секвенируют, а полученныйнабор их молекулярных масс используют для поиска в базе данных полипептидных последовательностей, в которых есть подпоследовательности69нужной молекулярной массы, образующиеся при обработке соответствующей протеазой. Такой подход получил название «пептидный фингерпринтинг».При необходимости секвенирования пептидов полученные ионы пептидов подвергают вторичной фрагментации в камере масс-спектрометра(например, за счет столкновения ускоренных заряженных ионов с атомамиHe или Ar).

При фрагментации пептидов в большинстве случаев разрывается только одна связь в пептидном остове. При этом пептид [M+H]+ распадается на две части, одна из которых несет положительный заряд и наблюдается детектором масс-спектрометра, а другая не заряжена и соответственно невидима. Заряд при этом может оставаться на любой из двух частей, поэтому разрыв каждой связи дает две наблюдаемые серии ионов.Поскольку разрываться может любая связь пептидного остова, то всегонасчитывается 6 основных серий, которые обозначаются буквами a, b, c, x,y и z с индексами, соответствующими числу атомов C в данном фрагменте. Легче всего разрыву подвергается амидная связь, поэтому обычно вспектре доминируют ионы серий b и y. Сопоставляя молекулярные массыобразовавшихся ионов в серии, можно вычислить разницу в массе междудвумя соседними ионами (например, yi и yi–1) и таким образом определитьприроду i-й аминокислоты (рис.

84). Таким образом, из молекулярныхмасс ионов в серии можно сделать вывод о последовательности соответствующего ей пептида. Однако в случаях, когда молекулярные массы двухаминокислот совпадают (например, лейцин и изолейцин), последовательность невозможно определить однозначно.

Дополнительную информациюо структуре пептида можно в ряде случаев получить и при фрагментации вопределенных условиях боковых радикалов. Большим преимуществоммасс-спектрометрического секвенирования является возможность установления аминокислот, подвергшихся посттрансляционной модификации(гликозилированию, метилированию и т. п.), которые отличаются по массеот нормальных.I.2.3.3. Установление третичной структурыГлавным методом, с помощью которого устанавливается третичнаяструктура белков, является рентгенострукутрный анализ кристаллическихобразцов. Как и в случае ДНК, получение монокристаллов белков являетсянепростой задачей.

Несмотря на это основная масса известных в настоящее время третичных структур белковых молекул и их комплексов получена по данным РСА.Данные о третичной структуре белков в растворе получают с помощьюметода ЯМР. При этом, хотя структуры все более крупных белковых молекул становятся доступными для расшифровки, современные методыЯМР позволяют надежно установить структуру белков массой не более7030 кДа, в то время как метод РСА не имеет принципиальных ограниченийна размер белка.I.2.4. Химический синтез пептидовПептидный синтез – синтез небольших (не более 45–50 остатков)фрагментов полипептидных цепей путем соединения аминокислот с помощью химических методов.Области применения синтетических пептидов достаточно разнообразны.

Химическим путем могут синтезироваться некоторые пептидные фармацевтические препараты – полипептидные антибиотки, гормоны и коферменты, нейромедиаторы, антитоксины. Синтезируют и аналоги природных пептидов с пролонгированным, усиленным или более избирательным действием. В исследованиях синтез используют для подтвержденияпредполагаемой структуры пептида или выявления связи между структурой пептида и его активностью.С химической точки зрения образование пептидной связи представляетсобой реакцию ацилирования аминогруппы:Рис. 85. Реакция ацилирования аминогруппыОчевидно, что для успешного синтеза достаточно длинного пептиданеобходимо соблюдение ряда условий.1. Специфичность – корректная последовательность соединения аминокислот. Специфичность синтеза достигается за счет использованиявременных и постоянных защитных групп.

Защите в ходе синтеза подлежат аминогруппа карбоксильного компонента, карбоксильная группааминокомпонента, а также способные ацилироваться группы боковыхрадикалов аминокислот.2. Высокие выходы на каждой стадии конденсации. Карбоксильная группа и аминогруппа не реагируют самопроизвольно, для этого необходима оптимальная активация.3. Оптическая чистота: все пептиды должны состоять из L-аминокислот, всвязи с чем возникает необходимость предотвратить рацемизацию входе синтеза.В общем случае синтез пептида состоит из трех основных стадий: защиты (блокирования) не участвующих в реакции функциональных групп,конденсации активированной карбоксильной группы одного компонента саминогруппой другого и удаления защитных групп (селективного илиполного деблокирования).

На рис. 86 показана реакция конденсации ами71нокомпонента (Y – защита по карбоксильной группе) и карбоксикомпонента (Z – защита по аминогруппе, X – активирующая группа).Рис. 86. Конденсация амино- и карбоксикомпонентаДля защиты аминогрупп широко применяют производные угольной кислоты (рис. 87), которые при взаимодействии с аминокислотами образуютсоединения ряда уретанов.Рис.

87. Структура производных угольной кислоты, используемых в пептидном синтезеК наиболее ярким примерам таких защитных групп относятся карбобензоксигруппа (Cbz) и трет-бутилоксикарбонильная группа (Boc):Рис. 88. Карбобензоксигруппа (слева) и трет-бутилоксикарбонильная группа (справа)Cbz-группа вводится ацилированием соответствующим хлорангидридом.Рис. 89. Введение Cbz-группыУдаляют её гидрогенолизом:72Рис. 90. Удаление Cbz-группытрет-Бутилоксикарбонильную защиту вводят с использованием ангидрида.Рис. 91.

Введение Boc-группыУдаляют Boc-защиту в кислой среде, при этом Boc-остаток дает толькогазообразные продукты.Рис. 92. Удаление Boc-группыЗащитные группы ацильного типа (рис. 93) не используют для защитыв качестве временных из-за невозможности их удаления без расщепленияпептидных связей. В качестве постоянных используют формильную итрифторацетильную защитные группы, например для защиты аминогруппы лизина. Тозильную группу используют редко из-за жёсткости условий удаления (обработка Na в жидком аммиаке).Рис. 93.

Защитные группы ацильного типаАлкильные защитные группы также применяют редко. В качестве примера можно упомянуть тритильную защитную группу (рис. 94), котораявводится с использованием соответствующего хлорида, а удаляется, на-73пример, мягким ацидолизом хлороводородом в органических растворителях.Рис. 94. Тритильная группа как пример алкильной защитной группыКарбоксильные группы, как правило, защищают образованием сложныхэфиров. Наиболее широко применяют бензиловые и трет-бутиловые эфиры, реже – метиловые и этиловые эфиры (рис. 95).

Характеристики

Список файлов книги