1625914757-8aba282c54d2a3a371a92e361d6fe93d (843812), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Если вернаконсервативная модель, после одного раунда репликации ДНК разделится85на 2 одинаковые полосы, плотность одной из которых (родительской) будет соответствовать плотности 15N-ДНК, а плотность второй (дочерней) –плотности 14N-ДНК. После второго раунда репликации удельное количество ДНК в легкой полосе увеличится, а в тяжелой – уменьшится. Если верна полуконсервативная модель, после одного раунда репликации вся ДНКостанется в одной полосе, плотность которой будет промежуточной между15N- и 14N-ДНК.
После второго раунда репликации половина ДНК перейдет в легкую полосу, а половина останется в полосе промежуточной плотности. Если же верна мозаичная модель, то после одного раунда репликации вся ДНК также останется в одной полосе промежуточной плотности,но после второго раунда репликации эта полоса не разделится, а сдвинетсяцеликом в сторону меньшей плотности. Результаты эксперимента Мезельсона – Сталя полностью совпали с предсказаниями для полуконсервативной модели.Рис. 108. Репликация кольцевого двуцепочечного генома по модели Кэрнса (с образованиемпромежуточной -структуры)Рис.
109. Репликация кольцевого двуцепочечного генома с образованием конкатемерногоодноцепочечного генома по модели катящегося кольца86Электронно-микроскопические наблюдения за репликацией кольцевыххромосом бактерий и вирусов показали, что существует два способа репликации таких геномов. Кольцевые хромосомы бактерий реплицируетсяпо модели Кэрнса (или -модели). Репликация при этом инициируется водной точке хромосомы, и участок синтезируемой ДНК распространяетсяв одну или в обе стороны от этой точки (рис.
108). По ходу процесса сначала образуется «глазок» из реплицировавшихся участков ДНК, затем онрасширяется настолько, что кольцевая ДНК напоминает греческую букву, и в конце концов две копии кольцевой хромосомы расходятся. Точка, вкоторой родительская двуцепочечная ДНК расходится на две дочерниедвуцепочечные ДНК, носит название репликативной вилки, и именно тампроисходит синтез ДНК.
Кольцевой геном многих вирусов реплицируетсяпо модели катящегося кольца (рис. 109). В одну из цепей вносится разрыв,который служит точкой начала репликации. Синтезируемая цепь постепенно вытесняет цепь, лежащую впереди нее. Таким образом образуетсяодноцепочечная ДНК, содержащая много копий исходного генома. Затемона разрезается на части размером в один геном, синтезируется втораяцепь, и двуцепочечная ДНК замыкается в кольцо.Рис. 110.
Репликация кольцевой бактериальной хромосомы: инициация на одном двунаправленном ориджине (oriC) и терминация на двух группах терминаторных последовательностей(ter), ориентированных в противоположных направленияхРис. 111. Репликация линейной эукариотической хромосомы: инициация на множественныхориджинах и терминация репликона при встрече двух репликативных вилок87Репликация бактериальных и эукариотических хромосом инициируетсяв специальных участках – ориджинах репликации (рис. 110).
В кольцевойбактериальной хромосоме имеется, как правило, только один ориджин(oriC у E. coli). Линейные хромосомы эукариот могут содержать несколькосотен ориджинов (в геноме человека насчитывается всего около 10 000ориджинов), репликация в которых инициируется не синхронно, а в определенном порядке, но не более одного раза за клеточный цикл (рис.
111).Терминация репликации у бактерий происходит также на специальныхучастках – терминаторах. В хромосоме E. coli имеется пять терминаторов, сгруппированных в два кластера: на терминаторах terE, terD и terAзаканчивается репликация, идущая от oriC в одну сторону, а на терминаторах terC и terB – репликация, направленная в противоположную сторону.
У эукариот терминация репликации происходит либо при встрече двух«глазков», инициированных на соседних ориджинах, либо при достиженииконца линейной хромосомы.Рис. 112. Реакция, катализируемая ДНК-полимеразамиГлавные ферменты, участвующие в репликации, катализируют синтезДНК по матрице ДНК и носят название ДНК-зависимые ДНК-полимеразы,или просто ДНК-полимеразы. В 1950-х гг.
А. Корнберг выделил из E. coliфермент, способный катализировать полимеризацию dNTP в присутствииДНК-матрицы – ДНК-полимеразу I. Однако затем были выделены жизнеспособные мутанты с нефункциональной ДНК-полимеразой I, что свидетельствует о том, что этот фермент не участвует в репликации. Впоследствии были открыты и другие ДНК-полимеразы. Сейчас у E. coli известны 5ДНК-полимераз, у высших эукариот – 14. Однако в репликацию вовлечены немногие из них: у E. coli – ДНК-полимераза III, у эукариот – ДНК88полимеразы , и . Остальные ДНК-полимеразы участвуют в ряде нерепликативных процессов, требующих матричного синтеза ДНК: репарации,рекомбинации и т. п.
Функция некоторых ДНК-полимераз (так называемых транслезионных полимераз) заключается в преодолении поврежденных оснований в ДНК, которые блокируют работу репликативных ДНКполимераз.Многолетние исследования биохимии разных ДНК-полимераз позволили охарактеризовать реакции, катализируемые этими ферментами(рис. 112). Все ДНК-полимеразы катализируют реакцию добавления dNMPна 3’-конец цепи ДНК; таким образом, ферментативный синтез ДНК всегда протекает в направлении 5’3’. Субстратами при этом служат dNTP иДНК, к которой предъявляются следующие требования: во-первых, 3’конец должен нести свободную 3’-гидроксильную группу, во-вторых,комплементарная цепь должна предоставлять dNMP, комплементарныйвключаемому.
Обычно ту цепь ДНК, в которую включается dNMP, называют праймером, а комплементарную ей цепь – матрицей. После включения одного dNMP комплекс ДНК-полимеразы с ДНК может диссоциировать на отдельные части; такая схема синтеза ДНК называется дистрибутивной. Однако в клетке при репликации обычно протекает процессивнаяреакция: после включения одного dNMP ДНК-полимераза не высвобождает ДНК, а связывает очередной dNTP, включает его, и этот цикл повторяется сотни или даже тысячи раз. Некоторые ДНК-полимеразы содержаттакже 3’5’- и 5’3’-экзонуклеазные активности, деградирующие ДНКдо отдельных dNMP в направлении 3’5’ и 5’3’ соответственно. Перваяиз этих активностей бывает важна для коррекции ошибок репликации: прислучайном включении неправильного dNMP (т.
е. dNMP, не комплементарного следующему dNMP в матричной цепи) ДНК-полимераза можетнемедленно отщепить его от 3’-конца праймера и включить на его местонормальный. Наличие 5’3’-экзонуклеазной активности позволяет ДНКполимеразам осуществлять важную в некоторых случаях ник-трансляцию,при которой ДНК одновременно синтезируется с одной стороны от молекулы фермента и расщепляется с другой стороны. Все реакции ДНКполимераз катализируются двухвалентными катионами Mg2+ или Mn2+.ДНК-полимераза I (рис. 113) представляет собой один полипептид массой 103 кДа (PolA). Ограниченным протеолизом ее можно разделить надва фрагмента: большой (фрагмент Кленова, 68 кДа), который несет ДНКполимеразную и 3’5’-экзонуклеазную активности, и малый (35 кДа),несущий 5’3’-экзонуклеазную активность.
Третичная структура фрагмента Кленова типична для всех ДНК-полимераз: молекула белка напоминает правую руку, в которой можно выделить «большой палец», «ладонь»и «пальцы». ДНК связывается в «ладони», а матричная цепь пропускаетсямежду «большим пальцем» и «пальцами». Реакция добавления dNMP на893’-OH-конец праймера имеет место в «складке» между «большим пальцем» и «ладонью».Рис. 113. ДНК-полимераза IВ отличие от ДНК-полимеразы I, основная репликативная ДНКполимераза E. coli, ДНК-полимераза III, состоит из трех отдельных полипептидных цепей (рис.
114). -Субъединица (белок DnaE) обладает ДНКполимеразнойактивностью,-субъединица(DnaQ)–3’5’экзонуклеазной активностью, а -субъединица (HolE) связывает эти двабелка в единый комплекс – кoровый фрагмент ДНК-полимеразы III. Прирепликации к коровому фрагменту добавляются еще несколько субъединиц для создания голофермента ДНК-полимеразы III, способного к процессивному синтезу ДНК.Рис. 114. ДНК-полимераза III90Ограничения, накладываемые на репликацию ДНК биохимическимисвойствами ДНК и ДНК-полимераз, порождают несколько проблем, которые должны быть разрешены для того, чтобы репликация протекала эффективно.
Во-первых, очевидно, что в репликативной вилке синтез ДНКдолжен осуществляться с использованием обеих антипараллельных матричных цепей ДНК, т. е. праймерные цепи должны расти в направлениикак 5’3’, так и 3’5’, в то время как ДНК-полимеразы ведут синтезтолько в направлении 5’3’. Во-вторых, ДНК-полимеразы неспособнывести синтез в отсутствие 3’-OH-группы праймера, следовательно, праймер должен синтезироваться независимо от ДНК-полимераз. В-третьих,при репликации цепи родительской ДНК должны каким-то образом разделяться впереди по ходу ДНК-полимеразы, что требует значительной энергии. В-четвертых, разделение цепей родительской ДНК должно иметь место и при инициации репликации еще до того, как ДНК-полимеразы начали синтез ДНК. В-пятых, механизм инициации репликации должен обеспечивать только один акт инициации с ориджина на протяжении одногораунда репликации. В-шестых, особую проблему представляет репликацияконцов линейной ДНК (см.
ниже).Рис. 115. Асимметричная репликация ДНКОсобая организация репликативной вилки позволяет решить первыетри из этих проблем. В 1968 г. Р. Оказаки показал, что при репликацииобразование новых цепей ДНК идет фрагментами размером ~1–2 тыс. п.н.(фрагменты Оказаки).
Оказаки метил культуры E. coli 3H-тимином напротяжении очень короткого времени (от 0,02 % до 2 % периода удвоения); радиоактивная метка при этом включалась во фрагменты такого размера и лишь позднее переходила в высокомолекулярную ДНК. Первоначально из этого был сделан вывод, что репликация протекает по прерывистой модели, в которой синтез ДНК в направлении 5’3’ инициируетсянеоднократно для каждой цепи. Однако позже было показано, что синтезодной из цепей (отстающая, или запаздывающая цепь) действительнопротекает с образованием фрагментов Оказаки, в то время как другая цепь(ведущая цепь) синтезируется непрерывно, а ее фрагментация объясняется91включением небольшого числа остатков dUMP и последующим временным расщеплением ДНК при их репарации (см. разд. «Репарация ДНК»).Такая модель репликации получила название полупрерывистой (рис.
115).Репликативная вилка, способная вести одновременно синтез ведущей иотстающей цепи, имеет довольно сложную структуру (рис. 116). В продвигающейся репликативной вилке матричная цепь для синтеза отстающейцепи разворачивается на 180° и образует петлю, так, чтобы синтез ДНКкак в направлении 5’3’, так и в направлении 3’5’ осуществлялся припродвижении ДНК-полимеразы в одну и ту же сторону («модель тромбона»).
Говорить о «продвижении» ДНК-полимеразы или репликативнойвилки можно только условно, поскольку на самом деле репликативныебелковые комплексы (реплисомы) неподвижно заякорены взаимодействиями с другими белками, а ДНК продергивается через них.Рис. 116. Строение репликативной вилки E. coli (по Goodman M.F.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
