1625914757-8aba282c54d2a3a371a92e361d6fe93d (843812), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Привыщеплении поврежденного основания в ДНК остается апуринапиримидиновый сайт, после чего фермент АП-эндонуклеаза вносит разрыв непосредственно с 5’-стороны от него, при этом образуются 3’-OH и5’-фосфатный концы. После этого ДНК-полимеразы встраивают один (репарация по короткому пути) или несколько dNMP (репарация по длинномупути), вытесненный 5’-конец ДНК гидролизуется специальными ферментами (дезоксирибофосфатлиаза или флэп-эндонуклеаза), и оставшийсяодноцепочечный разрыв лигируется ДНК-лигазами.Эксцизионная репарация нуклеотидов. Этот путь репарации задействуется в случае повреждений, сильно искажающих структуру ДНК (например, циклобутановых пиримидиновых димеров).
В наиболее хорошо изученной системе UvrABC E. coli повреждение распознается комплексомбелков состава UvrA2–UvrB–UvrC (рис. 128). Он вносит в ДНК 2 разрыва,один из которых отстоит от повреждения на 8 нуклеотидов в 5’направлении, а другой – на 5 нуклеотидов в 3’-направлении.
Затем ДНКполимераза I в комплексе с ДНК-геликазой UvrD синтезирует участок цепи ДНК, а участок, ранее содержавший повреждение, вытесняется в видесвободного олигонуклеотида. Процесс репарации завершает лигирование.Рис. 128. Эксцизионная репарация нуклеотидов106Репарация гетеродуплексов. Гетеродуплексы обычно возникают привключении ДНК-полимеразами не соответствующих матрице dNMP. Приэтом, поскольку оба некомплементарных dNMP являются каноническими,необходим механизм, позволяющий различить, какой из них находился вматричной цепи и, следовательно, не должен удаляться, а какой включилсяпри репликации и должен быть удален при репарации.Рис. 129. Метилнаправленная репарация гетеродуплексовВ E.
coli эта проблема решается с участием метилазы Dam, которая метилирует по положению N6 остатки Ade, находящиеся в палиндромныхпоследовательностях 5’-GATC-3’. Таким образом, сразу после репликацииэта последовательность метилирована в матричной цепи и на протяжениинескольких минут остается неметилированной во вновь синтезированнойцепи (рис. 129).
С такими полуметилированнными последовательностямиGATC связывается белок MutH. Димер белка MutS в свою очередь связы107вается с гетеродуплексом. Когда расстояние между MutH и MutS2 позволяет их взаимодействие, которое опосредовано третьим белком, MutL, проявляется эндонуклеазная функция белка MutH, который расщепляет неметилированную цепь в последовательности GATC. Этот разрыв служит субстратом для клеточных экзонуклеаз, которые гидролизуют вновь синтезированную цепь ДНК в направлении MutS2.
Гидролиз ДНК останавливаетсяпосле деградации гетеродуплексного участка, после чего недостающийучасток ДНК синтезируется ДНК-полимеразой III и происходит лигирование.Воссоединение негомологичных концов. Этот процесс важен для репарации двуцепочечных разрывов ДНК. В его ходе несколько звеньев поконцам двуцепочечного разрыва отщепляются с образованием тупых концов, которые затем лигируются; таким образом, теряется часть последовательности, в которой находился разрыв. Воссоединение негомологичныхконцов характерно в основном для клеток высших эукариот, основнуючасть генома которых составляет нефункциональная ДНК, поэтому рискпотери смысловой ДНК невелик. Также воссоединение негомологичныхконцов необходимо при процессах переформирования генов иммуноглобулинов, целью которого является создание новых последовательностейДНК.Последний способ репарации использует процесс гомологичной рекомбинации и будет рассмотрен ниже.Поскольку частота возникновения эндогенных повреждений ДНКсравнительно постоянна, а экзогенные генотоксические факторы присутствуют далеко не всегда, некоторые системы репарации работают постоянно, а другие способны индуцироваться при внешних генотоксическихвоздействиях.
Примером последнего механизма может служить SOSсистема бактерий. В норме под ее контролем находятся белки системыUvrABC, транслезионные ДНК-полимеразы II, IV и V и ряд других белковответа на генотоксический стресс, вызванный УФ-облучением. В регуляторных последовательностях их генов находится консервативная последовательность (SOS-бокс), которая в отсутствие УФ связывается с белкомрепрессором LexA.
Ген lexA сам находится под контролем SOS-системы,но низкого уровня его экспрессии достаточно, чтобы подавить синтез остальных белков SOS-системы. При УФ-облучении в ДНК возникают повреждения (циклобутановые пиримидиновые димеры), которые блокируютработу ДНК-полимеразы III. Из-за того, что пиримидиновые димеры возникают в случайных местах, продвижение коровых фрагментов ДНКполимеразы III в составе репликативной вилки блокируется не синхронно– в то время, как один из коровых фрагментов заблокирован, другой продолжает вести репликацию, и образуются протяженные участки одноцепочечной ДНК.
С ними связывается белок RecA, также находящийся под108контролем SOS-системы и синтезирующийся в отсутствие УФ на низкомуровне. Связывание с одноцепочечной ДНК активирует RecA, который всвою очередь связывает белок LexA, что активирует аутопротеазнуюфункцию последнего. Расщепление LexA приводит к тому, что он большене может репрессировать транскрипцию генов SOS-системы, и белки, находящиеся под ее контролем, накапливаются в клетке и начинают вестипроцессы репарации. В их числе активно синтезируется и сам белок LexA,но он тут же расщепляется под действием активированного RecA.
Послетого, как репарация ДНК прошла, репликация возобновилась и одноцепочечные участки ДНК исчезли, белок RecA не активируется, белок LexA нерасщепляется и вновь репрессирует гены SOS-системы (рис. 130).Рис. 130. SOS-система109II.6. Рекомбинация ДНКГомологичная рекомбинация – один из ключевых клеточных процессов, который вовлечен и в репарацию ДНК, и в нормальный обмен фрагментами хромосом при кроссинговере.
Лучше всего этот процесс изучен уE. coli. Обычно рекомбинация инициируется внесением одноцепочечныхразрывов в гомологичные молекулы ДНК или, чаще, двуцепочечного разрыва в одну из них.В первом случае белок RecA катализирует обмен 3’-концов (рекомбиногенных концов) между участками ДНК, между которыми существуетгомология, не обязательно полная, но превышающая некоторую пороговую величину. При этом образуется структура из 4-х цепей ДНК, называемая хиазмой, или холидеевским перекрестом (в честь Р.
Холидея, открывшего подобные структуры). Такой перекрест может перемещаться по ДНКна довольно большие расстояния; эта миграция катализируется комплексом белков RuvA и RuvB. Затем эндонуклеаза RuvC может расщепить холидеевский перекрест в одном из 2-х возможных направлений (рис. 131). Взависимости от направления этого разрешения рекомбинация может давать гетеродуплексный продукт (фрагмент одной из цепей в одной из молекул ДНК заменен на соответствующий фрагмент такой же другой измолекул ДНК) или продукт кроссинговера (в каждой из цепей ДНКпродукта реакции 5’-конец ранее принадлежал одной из исходных молекул ДНК, а 3’-конец – другой).Во втором случае ДНК по краям разрыва гидролизуется нуклеазойRecBCD таким образом, что образуются длинные (обычно несколько сотенили тысяч нт.) выступающие рекомбиногенные 3’-концы (рис.
132). БелокRecA катализирует внедрение (инвазию) рекомбиногенного конца в комплементарный ему участок двуцепочечной ДНК, при этом одна из ее цепейвытесняется в виде D-петли. ДНК-полимераза ведет синтез ДНК с дальнейшим вытеснением цепи и расширением D-петли. Когда D-петля достигает второго рекомбиногенного конца, под влиянием белка RecA происходит образование еще одного фрагмента двуцепочечной ДНК, которыйтакже служит для инициации синтеза ДНК. Дальнейшее расширение Dпетли приводит к образованию не одного, а двух холидеевских перекрестов, каждый из которых может быть разрешен двумя способами; такимобразом, может образоваться 4 возможных продукта рекомбинации – 2гетеродуплексных и 2 кроссинговерных (рис.
133). Следует заметить, что влюбом из этих продуктов часть последовательности, находившейся в области исходного двуцепочеченого разрыва, утеряна безвозвратно – еслипоследовательности двух молекул ДНК в этом районе не совпадали точно,то произойдет замещение последовательности в области двуцепочечного110разрыва соответствующей ей последовательностью из той молекулы ДНК,в которой разрыва не было.Рис. 131. Общая схема гомологичной рекомбинации111Рис.
132. Гомологичная рекомбинация, инициированная двуцепочечным разрывом112Рис. 133. Разрешение двойного холидеевского перекрестаII.7. МутагенезМутации являются движущей силой эволюции в целом и вместе с теммогут вызывать катастрофические последствия для отдельных организмов.По количеству затрагиваемого при мутации генетического материала ониделятся на геномные (изменение в числе хромосом), хромосомные (круп113номасштабные изменения отдельных хромосом) и точковые мутации (изменения, затрагивающие один или несколько нуклеотидов). Геномные ихромосомные мутации хорошо видны на цитологическом уровне, в товремя как точковые выявляются только при секвенировании. К основнымтипам геномных мутаций относятся полиплоидия – увеличение числа всеххромосом генетического набора и анеуплоидия – появление лишних копийили исчезновение копий одной или нескольких хромосом.
Из хромосомных мутаций (рис. 134) чаще всего встречаются делеции (выпадение участка хромосомы), дупликации (копирование участка хромосомы в месте,соседствующем с положением исходной копии), инверсии (поворот участка хромосомы на 180°) и транслокации (перенос участка хромосомы в другое ее место на другую хромосому). Остальные виды хромосомных мутаций представляют собой комбинации этих основных видов. В число точковых мутаций входят транзиции (замены пуринового или пиримидинового основания на другое основание того же типа), трансверсии (замены пуринового основания на пиримидиновое и наоборот), микроделеции (выпадение одного или нескольких нуклеотидов) и инсерции (вставка одногоили нескольких нуклеотидов). Транзиции и трансверсии могут не иметьвнешнего эффекта, если заменяют триплет, кодирующий одну аминокислоту, на триплет, кодирующий ту же аминокислоту, могут приводить кзамене аминокислоты (миссенс-мутации) или появлению стоп-кодона наместе триплета, кодирующего аминокислоты (нонсенс-мутации).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
