1625914757-8aba282c54d2a3a371a92e361d6fe93d (843812), страница 18
Текст из файла (страница 18)
При переходе к элонгации -фактор высвобождается изкомплекса с РНК-полимеразой, что приводит к изменению размера футпринта фермента с ~55 п.н. до 30–40 п.н. после синтеза первых 15–20 нуклеотидов РНК.Рис. 139. Кинетика инициации транскрипции120Все промоторные последовательности E. coli содержат два необходимых для узнавания более или менее консервативных элемента: (–10)последовательность (консенсус T80A95T45A60A50T96), центр которой расположен в районе нуклеотида (–10), и (–35)-последовательность (консенсусT82T84G78A65C54A45), центр которой расположен в районе нуклеотида (–35).Мутации в (–35)-последовательности приводят к снижению значения Kaдля РНК-полимераз, поэтому предполагается, что первоначальное узнавание промотора осуществляется именно в этой области.
С другой стороны,мутации в (–10)-последовательности не влияют на значение Ka, но снижают значение k2, что свидетельствует о важности этой AT-богатой областидля плавления ДНК. Кроме этого, РНК-полимераза узнает точку инициации, которая обычно расположена в последовательности CAT (точкойинициации является центральный A), и расстояние между (–10)- и (–35)последовательностями (~16–18 п.н., последовательность которых можетбыть любой).
Последний факт объясняется тем, что РНК-полимераза связывается с двойной спиралью ДНК только с одной стороны, на которой ирасположены (–10)- и (–35)-последовательности, а последовательностимежду ними находятся на противоположной стороне двойной спиралиДНК (рис.
140).Рис. 140. РНК-полимераза связывается с элементами ДНК, расположенными на одной и тойже стороне двойной спиралиВ разных промоторах структура (–10)- и (–35)-последовательностейразличается и может узнаваться разными -факторами. Общим для узнавания большинства промоторов является фактор 70, но ряд промоторовактивируется только в специальных случаях и требует специальных факторов. Например, факторы 32 и E служат для узнавания промоторовгенов, активирующихся при тепловом шоке, 54 – для узнавания промоторов генов, необходимых для переключения с NH4+ на другие источникиазота, а F – для промоторов генов, ответственных за синтез белков хемотаксиса и бактериального жгутика (флагеллы).Терминация транскрипции у E. coli может происходить на двух типахтерминаторов, которые называются -зависимыми и -независимыми в121зависимости от того, необходим ли для терминации белок -фактор.
Независимые терминаторы обычно представляют собой последовательности, образующие в РНК GC-богатые шпилечные структуры, за которымиследуют несколько звеньев U. Синтезировав такой участок, РНКполимераза делает длительную паузу, в ходе которой может диссоциировать из комплекса с ДНК. Медленная транскрипция также характерна идля -зависимых терминаторов.
Белок (комплекс из 6 идентичных субъединиц по 46 кДа каждая) связывает 5’-конец синтезированной РНК идвижется по ней в направлении 5’3’ с затратой энергии ATP. Когда белок догоняет медленно движущуюся РНК-полимеразу, происходит терминация (рис. 141). На действии -фактора основан так называемый полярный эффект нонсенс-мутаций: если РНК активно транслируется рибосомами, -фактор не может достичь РНК-полимеразы, но при наличиинонсенс-мутации рибосома диссоциирует из комплекса с РНК и можетпроисходить преждевременная терминация; при этом участки, расположенные в 3’-области транскрипционной единицы, могут не транскрибироваться. Терминация транскрипции может также регулироваться специальными белками-антитерминаторами, которые связываются с РНКполимеразой и предотвращают конформационные изменения в ней, ведущие к терминации.Рис. 141.
-Зависимая терминация транскрипцииТранскрипция у эукариот организована сложнее, чем у бактерий. В основной аппарат транскрипции эукариот входят 3 РНК-полимеразы: I, II иIII. Как правило, РНК-полимераза I транскрибирует гены рРНК, РНКполимераза II синтезирует мРНК, далее транслирующуюся в полипептиды,а РНК-полимераза III синтезирует тРНК и мяРНК. Биохимически эти ферменты различаются по чувствительности к ингибированию токсиномбледной поганки -аманитином: РНК-полимераза II ингибируется имсильно, РНК-полимераза I – слабо, а ингибирование РНК-полимеразы IIIнаходится на промежуточном уровне.
Кроме этого, несколько сотен различных белков – факторов транскрипции могут принимать участие в регуляции инициации, элонгации и терминации транскрипции у эукариот.Промоторы генов, транскрибируемых РНК-полимеразой I (рис. 142),состоят из двух элементов: корового промотора, занимающего область (–12245)–(+20), и элемента UCE (upstream control element), располагающегося вобласти (–180)–(–107).
При инициации транскрипции две молекулы фактора UBF1 связываются одна с коровым промотором, а другая с UCE. Затем с каждой из них связывается еще один транскрипционный фактор,SL1, состоящий из 4 белков. Один из этих белков, TBP (TATA-box bindingprotein), необходим и для инициации транскрипции РНК-полимеразами IIи III. После этого молекула РНК-полимеразы I присоединяется к комплексу UBF1–SL1, собранному на коровом промоторе; для эффективной инициации необходимо также взаимодействие этого комплекса с комплексомUBF1–SL1, собранным на UCE.Рис. 142.
Структура промоторов РНК-полимеразы I эукариотРис. 143. Структура промоторов РНК-полимеразы III эукариотСтроение промоторов генов, транскрибируемых РНК-полимеразой III,достаточно разнообразно (рис. 143). Иногда они состоят из двух элементов, бокса A и бокса B или бокса A и бокса C, находящихся в области(+55)–(+80).
Иногда же все элементы промотора расположены в нетранскрибируемой 5’-области и включают в себя элементы Oct, PSE и TATA123бокс – участки связывания различных белковых факторов транскрипции.Для инициации необходима посадка на промотор c помощью этих факторов комплекса TFIIIB, состоящего из нескольких субъединиц.Рис. 144. Структура промоторов РНК-полимеразы II эукариотИнициация транскрипции РНК-полимеразой II эукариот дает примерсложного процесса сборки транскрипционного комплекса, в котором участвуют десятки белков. В области (–30) подавляющего большинства такихпромоторов расположена последовательность TATA-бокс (рис.
144), с которым (и с областью с 5’-стороны от него) связывается фактор транскрипции TFIID, состоящий из белка TBP и еще 11 субъединиц (носящих общееназвание TAF – TBP-associated factors). Затем с 5’-стороны от TFIID связывается фактор TFIIA, а с 3’-стороны – фактор THIIB. К этому комплексуприсоединяется РНК-полимераза II, связанная с фактором транскрипцииTFIIF, который выполняет функции, аналогичные функциям бактериального -фактора. После этого с 3’-стороны от РНК-полимеразы связываетсяфактор транскрипции TFIIE, а с 5’-стороны – факторы TFIIH и TFIIJ.
Фактор TFIIH фосфорилирует некоторые аминокислотные остатки в Cконцевом домене РНК-полимеразы, что вызывает переход к стадии элонгации. При этом из комплекса с РНК-полимеразой высвобождаются всефакторы транскрипции, кроме TFIIH. Помимо TATA-бокса, в состав промоторов РНК-полимеразы II, могут входить в разных комбинациях и другие элементы (CAAT-бокс, GC-бокс, Oct-1, CTF, AP-1), которые связываются с разнообразными факторами транскрипции, регулирующими эффективность инициации.
Более того, некоторые участки ДНК (энхансеры),регулирующие инициацию транскрипции РНК-полимеразой II, могут располагаться в десятках тысяч п.н. от точки инициации. К таким участкамотносятся, например, сайты связывания рецепторов стероидных гормонов– факторов транскрипции, которые состоят из двух доменов: ДНКсвязывающего и трансактивирующего. При связывании с гормоном рецепторы димеризуются, связывают ДНК и активируют транскрипцию, взаимодействуя с РНК-полимеразой с образованием большой петли ДНК между энхансером и промотором регулируемых генов.124Рис.
145. Принципы метаболического контроля активности геновII.9. Регуляция транскрипцииРегуляция экспрессии генов на уровне инициации транскрипции можетвовлекать не один ген, а несколько. Такая единица регуляции (понятие оней было впервые сформулировано в 1953 г. Ф. Жакобом и Ж. Моно) называется опероном; регуляция оперонов представляет собой главный способ регуляции транскрипции у бактерий.
В составе оперонов выделяют125транс-действующие функциональные элементы (продукты экспрессии,например, белки) и цис-действующие функциональные элементы (промоторы, терминаторы, операторы – элементы ДНК, с которыми связываютсярегуляторные белки и т. п.). Гены, входящие в состав оперонов, делятся нарегуляторные (кодирующие белки или РНК, регулирующие экспрессиюдругих генов оперона) и структурные (продукты которых не принимаютнепосредственного участия в регуляции). Действие большинства регуляторных генов основано на связывании их белковых продуктов с цисэлементами оперона, в основном с операторами в промоторной областигенов.
Важно, что одни и те же регуляторные белки могут регулироватьэкспрессию генов, находящихся физически в разных местах генома. Например, белок TrpR регулирует экспрессию некоторых генов синтезатриптофана, находящихся в трех разных локусах, тем не менее, все ониобъединены в один оперон с точки зрения регуляции. Рассмотренный выше SOS-оперон включает более 20 генов, разбросанных по всему геному.С теоретической точки зрения все процессы регуляции на уровне инициации транскрипции можно разделить на 4 типа (рис. 145).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
