1625914757-8aba282c54d2a3a371a92e361d6fe93d (843812), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Annu. Rev. Biochem. 71:17–50; 2002)Ниже описана структура репликативной вилки E. coli (рис. 116,рис. 117). Впереди реплисомы в вилке движется ДНК-геликаза, состоящаяиз шести идентичных субъединиц белка DnaB. В природе известно большое количество ДНК-геликаз: это ферменты, которые связываются с одной из цепей ДНК и движутся по ней в направлении 5’3’ или 3’5’ (взависимости от конкретного фермента), используя энергию гидролиза ATP92для расплавления цепей ДНК и продвижения вперед (1–2 пары основанийна одну молекулу гидролизованного ATP). Для связывания ДНК-геликазнеобходим небольшой участок одноцепочечной ДНК.
ДНК-геликаза DnaBохватывает кольцом матричную цепь для синтеза отстающей цепи и движется по ней в направлении 5’3’. Это вызывает накопление позитивныхсупервитков впереди по ходу репликации, которые компенсируются негативными супервитками, вносимыми ДНК-гиразой – ферментом, состоящим из двух субъединиц (GyrA и GyrB), который также взаимодействует срепликативной вилкой.Рис. 117. Схема строения репликативной вилки E. coliРеассоциация одноцепочечных участков предотвращается их немедленным связыванием с белком Ssb (single-strand-binding protein – белок,связывающий одноцепочечную ДНК). Связывание белка Ssb с ДНК независит от ее последовательности и сильно кооперативно, т.
е. связываниеодной молекулы Ssb значительно облегчает связывание следующей. Такимобразом, участок одноцепочечной ДНК очень быстро покрывается стабильным филаментом из молекул Ssb, который может вытесняться толькоДНК-полимеразой. Важно подчеркнуть, что Ssb не способен сам расплавлять ДНК, а только предотвращает ренатурацию уже расплавленной ДНК.Следом за ДНК-геликазой в вилке движется фермент праймаза (белокDnaG в случае репликации с ориджина oriC) – специализированная РНКполимераза, которая синтезирует короткие РНК-праймеры для отстающейцепи.
3’-OH-концы этих праймеров используются далее для синтеза от93стающей цепи, который, как и синтез лидирующей цепи, ведется ДНКполимеразой III.Рис. 118. Реакция, катализируемая ДНК-лигазамиВ состав реплисомы входят два коровых фрагмента ДНК-полимеразыIII (см. выше), связанные между собой димером -субъединиц (белокDnaX). Каждый из коровых фрагментов также ассоциирован с димером субъединиц (белок DnaN).
Димер -субъединиц представляет собой кольцо, охватывающее двуцепочечную ДНК сзади от корового фрагмента; егоглавная функция заключается в обеспечении процессивности фермента.Один из двух коровых фрагментов, – тот, который ведет синтез отстающей94цепи – также связан с -комплексом, состоящим из субъединиц (продуктальтернативной транскрипции гена dnaX, который также кодирует субъединицу), (HolA), ’ (HolB), (HolC) и (HolD). -Комплекс узнаетРНК-праймер, синтезированный праймазой, вытесняет праймазу и в реакции, требующей гидролиза ATP, загружает на его 3’-конец сначала кольцо, а затем коровый фрагмент ДНК-полимеразы III.
По всей видимости, после синтеза одного фрагмента Оказаки завершивший работу коровый фрагмент освобождается из реплисомы, и -комплекс загружает новыйкоровый фрагмент и -кольцо на 3’-конец следующего РНК-праймера.Когда синтез фрагмента Оказаки заканчивается и реплисома достигает5’-конца предыдущего РНК-праймера, на смену ДНК-полимеразе III приходит ДНК-полимераза I. За счет своей 5’3’-экзонуклеазной активностиона деградирует РНК-праймер, одновременно достраивая ДНК на его месте.После замены всего РНК-праймера на ДНК между двумя фрагментамиОказаки остается разрыв между 3’-OH-группой вновь синтезированногофрагмента Оказаки и 5’-фосфатной группой предыдущего фрагмента. Такая брешь является субстратом для ДНК-лигазы (LigA), которая катализирует образование на ее месте фосфодиэфирной связи (рис.
118). Для получения энергии ДНК-лигазы используют гидролиз NAD+ (ДНК-лигазаE. coli и некоторых других бактерий) или ATP (большинство других ДНКлигаз), которые на первой стадии реакции ковалентно присоединяются кферменту, образуя макроэргическую фосфоамидную связь с остатком лизина в его активном центре. Далее остаток аденозин-5’-фосфата переносится на один из атомов кислорода 5’-фосфата при разрыве в ДНК (приэтом регенерируется немодифицированный фермент), а затем протекаетнуклеофильная атака атомом кислорода 3’-OH-группы при разрыве поатому фосфора -фосфата этого интермедиата. Таким образом, два соседних фрагмента Оказаки соединяются в одну цепь.Репликативная вилка эукариот организована по той же модели, что и убактерий, однако имеются и некоторые особенности.
В репликации эукариот принимает участие три ДНК-полимеразы: ДНК-полимераза выполняет функции праймазы, синтезируя РНК-праймер и последующий участок ДНК размером 3–4 нуклеотида, ДНК-полимераза синтезирует отстающую цепь, а ДНК-полимераза – ведущую цепь.
Фактор процессивности (PCNA, proliferating cell nuclear antigen) представляет собой гомотример, а не гомодимер, как в случае -кольца прокариот, а белок, связывающий одноцепочечную ДНК (RPA, replication protein A), является гетеротримером, но не мономером, как белок Ssb. Деградация РНК-затравкифрагментов Оказаки у эукариот происходит с помощью РНКазы H (фермент, расщепляющий РНК в дуплексе РНК–ДНК) и эндонуклеазы FEN195(фермент, отщепляющий «свисающие» участки ДНК или РНК после ихвытеснения работающей ДНК-полимеразой).Рис.
119. DnaA-зависимая инициация репликации E. coliДля инициации репликации требуется раскрытие ДНК в районе ориджина и сборка двух реплисом. У E. coli в инициацию репликации вовлечены белки DnaA, DnaB, DnaC, HU, Ssb и ДНК-гираза. В области ориджинарепликации oriC (245 нуклеотидов) находятся 4 повтора длиной 9 нуклеотидов с последовательностью TTATNCANA и 3 повтора длиной 13 нуклеотидов с последовательностью GATCTNTTNTTTT (рис.
119). Девятинуклеотидные повторы узнаются белком DnaA, который связывается сними кооперативно, так что на oriC собирается комплекс из 20–40 молекулDnaA. Это вызывает резкий изгиб ДНК в области oriC, что ведет к расплавлению AT-богатых 13-нуклеотидных повторов. На границе расплавленного и нерасплавленного участка связывается комплекс из 6 молекулгеликазы DnaB и 6 молекул белка DnaC, который играет роль фактора загрузки DnaB, а затем диссоциирует с гидролизом ATP. Геликаза DnaBпривлекает праймазу DnaG для синтеза первого праймера отстающей цепи; механизм синтеза праймера ведущей цепи не выяснен.
Белок HU (гетеродимер полипептидов HupA и HupB), по-видимому, поддерживает структуру расплавленного ориджина на ранних этапах инициации, а роль ДНКгиразы аналогична ее роли при продвижении репликативной вилки.Репликация E. coli заканчивается на терминаторных последовательностях ter. Они содержат сайты узнавания белком Tus, который ингибируетплавление ДНК геликазой и таким образом останавливает движение репликативной вилки.Процесс обеспечения однократной инициации репликации на ориджине за цикл репликации носит название лицензирования ориджина.
У E. coliлицензирование oriC зависит от присутствия ДНК-метилазы Dam(deoxyadenosine methylase). В oriC содержится 13 последовательностейGATC – сайтов узнавания Dam. Перед репликацией все последовательности GATC в геноме метилированы по остаткам аденина в обеих цепях. По96сле прохождения репликации они становятся полуметилированными, таккак в дочернюю цепь включается неметилированный dAMP, и восстановление полностью метилированного GATC осуществляется под действиемфермента Dam.
Вне oriC эта реакция проходит быстро, и через 1,5 минпосле репликации все сайты GATC полностью метилируются. В oriC, однако, они узнаются комплексом белков SeqE и DnaA, что замедляет метилирование до ~13 мин и блокирует повторную инициацию. Повторнаяинициация возможна только после полного восстановления метилирования GATC в oriC.Лицензирование ориджинов эукариот подробно исследовано на примере дрожжей.
Ориджин постоянно связан с белковым комплексом ORC(origin recognition complex, состоит из 6 полипептидов). В ранней фазе G1с ORC связывается белок Cdc6p, который синтезируется только в фазе G1и очень нестабилен (время полураспада ~5 мин). Связывание Cdc6p в своюочередь позволяет связаться комплексу, состоящему из белков Mcm2p,Mcm3p и Mcm5p, необходимому для инициации. При инициации репликации белки Cdc6p и Mcm вытесняются с ориджина, белок Cdc6p деградирует, и повторная сборка на ориджине комплекса, необходимого для инцииации, становится невозможной.
Дополнительный контроль инициациидостигается за счет того, что белки Mcm не имеют сигнала ядерной локализации (см. разд. «Транслокация белков») и поэтому могут попасть в ядротолько при митозе, когда ядерная мембрана распадается и формируетсявновь.Репликация концов линейной ДНК эукариот представляет особую проблему. Поскольку синтез отстающей цепи не может быть инициирован насамом конце линейной двуцепочечной ДНК, после каждого цикла репликации последовательности, расположенные между концом ДНК и сайтоминициации последнего фрагмента Оказаки, должны теряться. Однако особая структура концевых последовательностей ДНК (теломер) позволяетобойти эту проблему.
Впервые репликация теломер была исследована уинфузории Tetrahymena, у которой, как и у всех инфузорий, в соматическим ядре (макронуклеусе) имеется много тысяч линейных минихромосом.Теломеры состоят из большого числа консервативных коротких гексамерных повторов: у человека – TTAGGG, у Tetrahymena – TTGGGG. Активноделящиеся клетки эукариот содержат специальный фермент для репликации концов ДНК – теломеразу. Теломераза представляет собой рибонуклеопротеин, содержащий молекулу РНК (159 нуклеотидов в теломеразеTetrahymena), в которой имеется последовательность AACCCCAAC (в теломеразе Tetrahymena).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
