1625914757-8aba282c54d2a3a371a92e361d6fe93d (843812), страница 9
Текст из файла (страница 9)
66) во всех звеньях полипептиднойцепи углы поворота вокруг простых связей имеют одинаковые величину изнак. Такая структура дополнительно стабилизируется внутримолекулярными водородными связями между карбонильным атомом кислорода иамидным атомом азота, принадлежащими к удаленным друг от друга аминокислотным остаткам. При формировании классической -спирали карбонильный кислород i-го аминокислотного образует водородную связь с58амидным азотом i+4-го остатка. При этом на один виток спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка. В белках встречаются только правозакрученные -спирали.Аналогично при помощи регулярно расположенных водородных связейстабилизируются -структуры, которые бывают параллельными и антипараллельными (рис. 67).Рис. 67.
Фрагмент структуры параллельного (сверху) и антипараллельного (снизу) -листаI.2.2.2. Третичная структураТретичная структура полипептидной цепи, как правило, представляетсобой комбинацию взаимодействующих между собой элементов вторичной структуры и неструктурированных участков цепи. Для многих белковтретичная структура эквивалентна полной пространственной структуре.Каждый белок обладает своей уникальной пространственной структурой.В формировании третичной структуры участвуют ковалентные связимежду боковыми цепями остатков цистеина, а также все перечисленныевыше нековалентные взаимодействия.Элементы вторичной структуры по-разному представлены в третичнойструктуре различных белков. Существуют белки, практически полностьюпостроенные из -спиралей или -складок.
Но у подавляющего большин-59ства белков в третичной структуре наблюдается комбинация этих мотивов(рис. 68).интерлейкин-10рибонуклеаза Аинтерлейкин-18Рис. 68. Структура некоторых белковI.2.2.3. Четвертичная структураМногие белки состоят из нескольких полипептидных цепей, причемцепи в составе белка могут быть как одинаковыми, так и различными. Приэтом каждая цепь, как правило, принимает собственную третичную структуру.
Эти составные части белка называют субъединицами. Субъединицытакже могут удерживаться вместе за счет ковалентных и нековалентныхвзаимодействий. На рис. 69 показана структура бактериальной глутаминсинтетазы, состоящей из 12 симметрично расположенных субъединиц.Рис. 69. Структура глутаминсинтетазы60I.2.2.4. Денатурация и ренатурация белковПри денатурации белков наблюдается разрушение специфической пространственной структуры (четвертичной, третичной и вторичной). Пептидная цепь денатурированного белка укладывается хаотично, и ее конформационные характеристики принимают случайные значения.
Денатурация может быть вызвана изменением любого из целого ряда параметров:температуры, pH среды, ионной силы раствора. Также денатурация происходит при добавлении ряда реагентов, таких как мочевина, гуанидин, детергенты, восстановители.Важной проблемой является проблема обратимости денатурации. Какправило, при возвращении молекулы белка в оптимальные условия наблюдается восстановление нативной структуры. Изучение процессов денатурации и ренатурации позволяет лучше понять конформационные особенности белков, устойчивость их пространственной структуры и природувзаимодействий, важных для стабилизации нативной конформации и проявления биологической активности.I.2.3.
Методы установления структуры белковПрежде чем приступить к установлению полной пространственнойструктуры белка, необходимо иметь представление о его субъединичномсоставе и первичной последовательности его полипептидных цепей.Для этого необходимо провести диссоциацию белка на субъединицы.Обычно это достигается с помощью гидрохлорида гуанидина, мочевиныили додецилсульфата натрия. Добавление меркаптоэтанола позволяет разрушить ковалентные дисульфидные связи. Разделение субъединиц и установление их массы можно провести различными методами, например,центрифугированием или электрофорезом.I.2.3.1.
Установление первичной последовательности пептидовТак же как и при установлении первичной последовательности полинуклеотидов, при секвенировании полипептидов применяют блочный метод. Наборы перекрывающихся фрагментов обычно получают при помощиспецифических эндопептидаз. Примеры таких ферментов – сериновыепротеазы трипсин и химотрипсин. Трипсин расщепляет пептидные связи,образованные карбоксильными группами основных аминокислот (аргинина или лизина), а химотрипсин расщепляет пептидные связи, образованные карбоксильными группами аминокислот с объемными гидрофобнымибоковыми радикалами (фенилаланин, тирозин, триптофан). Триптическиеи химотриптические гидролизаты полипептидов можно использовать вкачестве перекрывающихся блоков.Основы анализа первичной последовательности полипептидов былиразработаны Ф. Сэнгером.
Классическое секвенирование включает в себя61несколько стадий. Первая стадия – определение аминокислотного состава.Затем проводится установление концевых аминокислотных остатков. Далее пептид фрагментируют и устанавливают структуру блоков.Определение аминокислотного состава белков проводят после количественного расщепления всех пептидных связей. Поскольку пептиднаясвязь очень стабильна, условия гидролиза должны быть очень жесткими.Используют гидролиз в кислых условиях (6 М HCl, 100 °С, 24 ч.) или щелочной гидролиз (5 М NaOH, 100 °С, до 24 ч.).Механизм кислотного гидролиза приведен на следующей схеме:Рис. 70.
Кислотный гидролиз белковОчевидно, что кислотный гидролиз пептидных связей сопровождаетсягидролизом амидов аспарагиновой и глутаминовой кислот. Еще одной побочной реакцией является расщепление триптофана.Рис. 71. Щелочной гидролиз белковЩелочной гидролиз пептидов (рис. 71) применяется реже, посколькуселективность этой реакции ниже, чем в случае кислотного гидролиза. В62щелочных условиях разрушаются остатки аргинина, цистеина, серина,треонина и тирозина.Процесс щелочного гидролиза также сопровождается рацемизацией,протекающей через образование енолят-аниона:Рис. 72. Рацемизация при щелочном гидролизе белковПосле гидролиза реакционную смесь разделяют с помощью ионообменной хроматографии. Поскольку большинство аминокислот мало поглощают в ультрафиолетовом диапазоне, для детекции их превращают вокрашенные производные.
Этот принцип использован в автоматическихаминокислотных анализаторах. В стандартизованных условиях ионообменной хроматографии аминокислоты идентифицируют по времени удерживания на колонке, а непосредственная детекция осуществляется по окрашенному производному. Примером такой реакции может служить реакция с нингидрином:Рис. 73. Реакция с нингидриномКак видно из представленной схемы, в процессе реакции происходитотщепление фрагмента аминокислоты в виде альдегида. Аминогруппа приэтом остается в составе продукта превращения молекулы нингидрина.
Далее он реагирует со второй молекулой нингидрина и образуется соединение (рис. 74), которое с высокой интенсивностью поглощает свет в видимой области (максимум поглощения при 570 нм – пурпурная окраска).63Рис. 74. Хромофор, образующийся после реакции аминокислот с нингидриномИсключение составляет иминокислота пролин, с которой может прореагировать только одна молекула нингидрина. Продукт этой реакции окрашен в желтый цвет. Относительное содержание конкретной аминокислоты в пептиде определяется по интенсивности регистрируемого пика.Рис. 75. Реакция с динитрофторбензоломРис. 76.
Реакция с дансилхлоридом64Аминокислотные остатки, находящиеся на N-конце пептида, могутбыть идентифицированы при помощи реактива Сэнгера (динитрофторбензола, рис. 75) или дансилхлорида (рис. 76). Эти реагенты специфично взаимодействуют с концевой аминогруппой пептида.Далее проводится полный гидролиз пептидной цепи и идентификациимодифицированного N-концевого остатка методом хроматографии в присутствии стандартов.C-концевой аминокислотный остаток может быть определен с помощью гидразинолиза по Акабори (рис. 77).
Обработка пептидной цепи безводным гидразином при высокой температуре (100–120 °С) приводит красщеплению всех пептидных связей с образованием гидразидов всехаминокислот, кроме C-концевой, имеющей свободную карбоксильнуюгруппу. Эта аминокислота может быть легко выделена и идентифицирована. Процесс сопровождается рядом побочных реакций (разрушение амидоваспарагиновой и глутаминовой кислот, цистеина и аргинина).Рис. 77. Гидразинолиз по АкабориТакже C-концевой аминокислотный остаток можно идентифицироватьпри помощи оксазолонового метода (метода тритиевой метки, рис.
78).Обработка полипетидной цепи уксусным ангидридом приводит к образованию C-концевого оксазолона:Рис. 78. Метод тритевой меткиВ составе оксазолона подвижный атом водорода обменивается на тритий. Таким образом, концевая аминокислота получает радиоактивную мет-65ку и может быть идентифицирована после полного кислотного гидролизаполипептидной цепи.Существует также ферментативный метод определения C-концевых остатков. Он основан на использовании различных карбоксипептидаз – экзопептидаз, гидролизующих пептидные связи, образованные C-концевымиаминокислотами. При проведении гидролиза полипептидной цепи такимиэкзонуклеазами из реакционной смеси через определенное время отбираюталиквоты и анализируют их состав.
Первой в реакционной смеси накапливается концевая аминокислота, затем – следующая и т. д. Таким образомможно установить порядок расположения на C-конце пептида несколькихаминокислотных остатков.Для фрагментации пептидов на блоки, кроме описанных выше ферментативных методов, можно использовать селективные химические реакции.Ярким примером такой реакции служит фрагментация пептидных цепейбромцианом по остаткам метионина:Рис.
79. Фрагментация белка бромцианом по остаткам метионинаДля секвенирования фрагментов, полученных при фрагментации полипептида, традиционно используют метод Эдмана (рис. 80). Этот методпредставляет собой поэтапную деградацию пептидной цепи, т. е. последовательное отщепление аминокислотных остатков с N-конца под действиемфенилизотиоцианата. Взаимодействие фенилизотиоцианата с N-концевойаминогруппой пептида приводит к отщеплению N-концевой аминокислоты с образованием тиазолинонового цикла, который затем изомеризуется вфенилтиогидантоин соответствующей аминокислоты:66Рис.
80. Секвенирование по ЭдмануФенилтиогидантоин может быть идентифицирован хроматографическис использованием стандартов. Пептид, укороченный на одну аминокислоту, вновь подвергают обработке фенилизотиоцианатом. Максимальноеколичество аминокислотных остатков, которое можно идентифицироватьэтим методом, достигает 50.Сульфгидрильные группы остатков цистеина играют важную роль вструктуре белка. Они реакционноспособны при нормальных условиях,поэтому SH-группы защищают алкилированием или окислением ещё напервом этапе установления первичной структуры белка. Для установленияколичества свободных и связанных дисульфидными мостиками групп используют реагент Эллмана – 5,5’-дитиобис-(2-нитробензойную кислоту).Реагент Эллмана взаимодействует со свободными сульфгидрильнымигруппами, давая в качестве второго продукта тионитробензойную кислоту(рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
