1625914757-8aba282c54d2a3a371a92e361d6fe93d (843812), страница 5
Текст из файла (страница 5)
32. Элементы структуры одноцепочечных нуклеиновых кислотТретичная структура одноцепочечных нуклеиновых кислот чрезвычайна важна для осуществления белково-нуклеиновых взаимодействий.Именно точное узнавание третичной структуры является определяющимфактором при аминоацилировании транспортных РНК (рис. 33), обеспечивающем впоследствии безошибочность белкового синтеза (см. разд. «Син31тез белка по матрице РНК»).
Не менее важна точность формирования третичной структуры в случае рибосомальных РНК, выступающих одновременно в роли каркаса для сборки рибосомы и в роли катализатора синтезабелка. Структура рибосомальных РНК очень консервативна, а большинство мутаций в их генах летальны.Рис. 33. Вторичная и третичная структура тРНК, структура минорных нуклеозидовПри формировании третичной структуры одноцепочечных нуклеиновых кислот важнейшими нековалентными взаимодействиями также являются водородные связи и стэкинг.
Следует также отметить, что окружениемолекулы (белки, вода, противоионы) играет при этом очень важную роль.Эффективность стэкинга определяется типом основания и геометриейвзаимодействия. Водородные связи можно разделить на три группы: основание–основание, основание–остов и остов–остов. В спиральных участкахреализуются только взаимодействия основание–основание. В нерегулярных участках конформация остова позволяет сближение различных функциональных групп. Как следствие, в нерегулярных участках реализуютсявсе три типа водородных связей.
Большую роль в образовании третичнойструктуры тРНК и рРНК играют встречающиеся в них минорные нуклеозиды, обладающие дополнительными группами, способными образовыватьводородные связи. Еще одним вариантом взаимодействия остов–остов является сближение фосфатных групп, при котором возникает сайт прочногосвязывания для ионов металлов.32I.1.5. Методы исследования структуры нуклеиновых кислотВ установлении структуры нуклеиновых кислот огромную роль сыгралметод рентгеноструктурного анализа (РСА), с помощью которого былиполучены данные, позволившие обнаружить спиральные структуры нуклеиновых кислот. Метод основан на явлении дифракции рентгеновскогоизлучения на трехмерной кристаллической решетке.
В случае нуклеиновых кислот (как и других биомолекул) для исследования используютсямолекулярные кристаллы. Получение таких кристаллов в случае большинства биомолекул само по себе является нетривиальной задачей. Тем неменее, до настоящего времени методом РСА установлены структуры множества различных нуклеиновых кислот, как самостоятельных, так и в составе комплексов с другими молекулами, и в первую очередь с белками.Разрешающая способность метода очень высока: в случае биомолекул самые подробные структуры имеют разрешение менее 1 A. Метод РСА внастоящее время является одним из наиболее распространенных методовустановления структуры веществ.
К сожалению, любой метод имеет и своинедостатки. Помимо сложности получения кристаллов следует отметитьдругую проблему, неизменно возникающую при интерпретации данныхРСА. Этот метод позволяет получить данные только для кристаллическихструктур, взаимосвязь которых с истинной структурой биомолекулы в растворе в принципе неочевидна. К счастью для исследователей, во множестве случаев существуют прямые корреляции между структурой вещества вмолекулярном кристалле и его нативной структурой в растворе.Исследовать нативную структуру нуклеиновых кислот в растворе значительно сложнее. Наиболее подробную структурную информацию можнополучить, применяя метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Приисследовании структуры макромолекул методом двумерного ЯМР используют так называемый ядерный эффект Оверхаузера, заключающийся в переносе поляризации ядерных спинов между достаточно сближенными ядрами.
К сожалению, данный метод позволяет устанавливать структурулишь относительно небольших молекул и комплексов.Метод аффинной модификации весьма трудоемок. Данные, полученныеэтим методом, не всегда можно однозначно интерпретировать. Однако доразвития двумерного ЯМР только метод аффинной модификации биополимеров позволял получить информацию о нативной структуре биополимеров в растворе.Метод аффинной модификации биополимеров разработан для исследования специфических взаимодействий между молекулами. Наиболее частоего использовали при исследовании взаимодействия между молекуламинуклеиновых кислот, молекулами белков и нуклеиновых кислот, а такжевзаимодействий между белками и низкомолекулярными соединениями.При этом в состав одной из молекул (реагента) вводят реакционноспособ33ную группу.
Реагент образует комплекс с другой молекулой – мишенью.Как только реакционноспособная группа реагента оказывается достаточносближена с любой из групп мишени, способной участвовать в реакции,происходит химическая модификация мишени. Далее проводится ее детальное исследование для выявления места модификации. На основанииполученных данных можно с достаточно высокой точностью определить,на каком расстоянии располагались модифицирующая и модифицируемаягруппы в составе комплекса. Таким образом, с помощью метода всегдаможно получить данные о взаимном расположении молекул в структурекомплекса. Если и реагент и мишень представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, то благодаря принципу комплементарности при помощиметода аффинной модификации можно получать информацию о последовательности мишени.
Разумеется, последовательность реагента в данномслучае должна быть известна заранее.I.1.6. Гель-электрофорез нуклеиновых кислотИсследование структуры и функций нуклеиновых кислот невозможнобез аналитического метода, позволяющего надежно идентифицироватьразличные нуклеиновые кислоты.
Для этой цели служит метод гельэлектрофореза. Явление электрофореза представляет собой движение заряженных частиц в электрическом поле. Подвижность частицы в общемслучае зависит от ряда ее собственных характеристик (заряд, масса, объем), ряда характеристик среды (диэлектрическая проницаемость, вязкость,плотность) и напряженности электрического поля. Если вместо непрерывной среды использовать гель, представляющий собой молекулярную сеть,то подвижность молекул будет в большей степени определяться размерамипор геля: чем меньше размер молекулы, тем выше ее подвижность приэлектрофорезе в геле.
Наиболее часто при исследовании нуклеиновых кислот применяют гели двух типов: агарозные и полиакриламидные. Агароза– неразветвленный полисахарид, который образует гели при охлаждениирастворов определенной концентрации (рис. 34).Рис. 34. Структура полимера агарозыАгарозные гели применяют для разделения достаточно крупных молекул нуклеиновых кислот (от сотен до миллионов пар оснований).34Полиакриламидные гели получают полимеризацией акриламида в присутствии N,N-метиленбис-акриламида (рис.
35).Рис. 35. Структура мономеров акриламида и полимакриламидаВарьируя концентрацию акриламида и бисакриламида, можно задаватьнеобходимый размер пор геля. Основное достоинство полиакриламидныхгелей – высокая разрешающая способность. С их использованием можноотделить друг от друга нуклеиновые кислоты, отличающиеся по длине наодин нуклеотид при общей длине молекулы до 200 нуклеотидов.I.1.7. Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислотКомплементарные взаимодействия между молекулами нуклеиновыхкислот позволяют использовать молекулы с известной последовательностью нуклеотидов для анализа молекул с неизвестной последовательностью за счет образования комплементарных комплексов.
Аналитическийметод, основанный на этом принципе, называют методом молекулярнойгибридизации. В основе метода лежит образование специфического комплекса (гибрида) между зондом (известной молекулой) и мишенью (анализируемой молекулой). Зонд содержит в своем составе метку – атом илигруппу атомов, позволяющих детектировать его присутствие. Наиболеечасто в качестве метки используют радиоактивные атомы (например, изотоп 32Р в составе фосфатной группы) или флуоресцентные красители.Комплексы, образованные радиоактивно меченым зондом, детектируютконтактной экспозицией рентгеновской пленки.
Флуоресцентные зондыдетектируются при возбуждении светом с определенной длиной волны.Выбор последовательности зонда определяется конкретной задачей исследования. Результат – детекция специфического комплекса – однозначноуказывает на наличие в исследуемой молекуле последовательности, комплементарной последовательности зонда. Существует множество разно-35видностей метода, отличающихся способом детекции гибридного комплекса.При гетерогенной гибридизации один из компонентов гибридногокомплекса иммобилизуют на каком-либо твердом носителе (стекло, органический полимер). В этом случае отделение избытка меченого зонда отспецифического комплекса проводится простой промывкой, а регистрациясигнала от метки на носителе свидетельствует о формировании гибридного комплекса.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
