1625914757-8aba282c54d2a3a371a92e361d6fe93d (843812), страница 7

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 7)

Мечение растущей цепи можно осуществить различными способами: ввести радиоактивную метку в состав праймера илиddNTP. В состав ddNTP можно включить и различные флуоресцентныекрасители, отличающиеся спектрами флуоресценции (рис. 47). В этом случае можно проводить всего одну реакцию полимеризации с добавлениемвсех четырех ddNTP, а полученные фрагменты различать по спектрамфлуоресценции. Это открывает возможность для автоматизации метода, иименно автоматический вариант метода Сэнгера применяется повсеместнов настоящее время.

ДНК-секвенатор представляет собой комбинацию установки для капиллярного электрофореза с высоким разрешением и флуоресцентного детектора. Управление прибором осуществляется с помощьюперсонального компьютера. Использование автоматических секвенаторовзначительно повышает и без того высокую производительность методаСэнгера. В одном эксперименте можно «прочитать» последовательностьдлиной до 500 нуклеотидов, а наиболее современные приборы могут одновременно секвенировать до 96 образцов.43Рис. 47.

Примеры структур ddNTP, содержащих остатки красителей на основе родаминаI.1.9. Химический синтез олигонуклеотидовХимически синтезированные олигодезоксирибонуклеотиды можно использовать для конструирования целых генов или их фрагментов, для получения направленных мутаций в ДНК, а также в качестве зондов при гибридизации и праймеров при амплификации ДНК и секвенировании по методу Сэнгера. Химически синтезированные последовательности РНК –олигорибонуклеотиды – широко используются в исследовательской практике в качестве инструментов регуляции уровня экспрессии генов.При химическом синтезе биополимеров с заданной последовательностью неизбежно возникает проблема обеспечения химической селективности (рис.

48), которая решается с помощью защитных групп. Для получения блоков, из которых впоследствии будет строиться олигонуклеотиднаяцепь, необходимо ввести в состав нуклеотида защитные группы – постоянные (защищающие определенные положения в течение всего синтеза) ивременные (защищающие положения, атака которых недопустима на данной стадии). Управление селективностью конденсации осуществляется засчет удаления определенных временных защитных групп.44Рис. 48. Возможные направления нуклеофильной атаки при конденсации двух незащищенныхнуклеотидовНа заре развития химических методов синтеза олигонуклеотидов время, необходимое для выполнения всех стадий соединения между собойдвух нуклеотидов или двух фрагментов олигонуклеотида, исчислялосьднями и даже неделями. При использовании современных методов этапроцедура занимает в среднем пять минут.

Решающую роль в ускорениисинтеза сыграл переход от традиционной активации фосфатных групп киспользованию производных трехвалентного фосфора. Также важнуюроль в развитии методов химического синтеза олигонуклеотидов сыгралоприменение твердофазного варианта синтеза, обладающего двумя значительными преимуществами. В твердофазном варианте первое звено олигонуклеотидной цепи ковалентно закрепляется на твердом (нерастворимом)носителе: стекле или полистироле.

Все стадии выделения промежуточныхпродуктов при этом сводятся к обычной промывке носителя растворителем. Вторым преимуществом является возможность автоматизации процесса.С появлением приборов для автоматического химического синтезануклеиновых кислот (НК-синтезаторов) получение олигонуклеотидов длиной < 100 звеньев стало рутинной процедурой. НК-синтезатор представляет собой систему клапанов и насосов, с помощью которых в реактор позаданной программе вводятся нуклеотиды и реагенты, обеспечивающиеприсоединение нужных мономерных единиц к растущей цепи. Все реакции осуществляются последовательно в одной реакционной колонке (реакторе), а продолжительность каждой из них и время промывок контролируются с помощью компьютера.В настоящее время наиболее распространенный метод химическогосинтеза нуклеиновых кислот – фосфитамидный метод. Исходнымистроительными блоками в нем являются модифицированные нуклеозиды.Модификация состоит в присоединении к аминогруппам дезоксиаденозинаи дезоксицитидина защитной бензольной (Bz) группы, а к аминогруппедезоксигуанозина – изобутирильной (i-Bu).

Это постоянные защитные45группы. Тимидин, у которого отсутствует аминогруппа, не модифицируют. Такая модификация необходима для защиты нуклеозидов от нежелательных побочных реакций при росте цепи.Синтез осуществляют твердофазным методом, что позволяет проводитьвсе реакции в одной емкости, легко отмывать после каждого этапа ненужные реагенты и добавлять новые в количестве, обеспечивающем возможноболее полное протекание реакции.

Первый нуклеозид фиксируют наинертном твердом носителе (рис. 49). Обычно это пористые стеклянныешарики с порами одинакового размера. Иногда используют полимерныйноситель на основе полистирола. 3’-гидроксильная группа первого нуклеозида, который является 3’-концевым нуклеотидом синтезируемой цепи,прикрепляется к спейсерной молекуле, ковалентно связанной с носителем.Рис. 49. Присоединение первого нуклеозида к носителю при твердофазном синтезеРис. 50. Структура мономера для фосфитамидного синтезаГидроксильную группу в 5’-положении временно защищают с помощью диметокситритильной группы (DMTr). Каждый модифицированныйнуклеозид, кроме первого, дополнительно содержит амидофосфитнуюгруппировку.

Остаток цианэтанола в ее составе представляет собой постоянную защитную группу. Остаток диизопропиламина подобран в качестве46хорошей уходящей группы. Таким образом, полученная молекула представляет собой амидофосфит защищенного дезоксинуклеозида (рис. 50).Полимер с присоединенным к нему первым звеном помещают в реактор. Реакции проводят в достаточно инертных безводных растворителях(ацетонитрил, хлористый метилен). На первом этапе с помощью раствораорганической кислоты, например трихлоруксусной, отщепляют 5’-DMTrгруппу от первого нуклеотида (реакция детритилирования), чтобы экспонировать реакционноспособную 5’-гидроксильную группу (рис. 51).

Прочие защитные группы в кислых условиях стабильны.Рис. 51. Реакция детритилированияONDMTrNHOONNONH i-BuNNOPDMTrN NONHOONNNNH i-BuNHNNH BzONH BzNNOPNNOOHONNONNNOOSiSiРис. 52. Активация амидофосфита и конденсацияПродукты детритилирования и кислоту удаляют промывкой. На второмэтапе в реактор одновременно вводят тетразол и амидофосфит второгонуклеозида. Под действием тетразола происходит активация амидофосфита и присоединение второго нуклеозида к первому с образованием фосфиттриэфира (рис. 52).47К сожалению, степень превращения в реакциях органического синтезаникогда не достигает 100 %. Это означает, что даже при самом благоприятном исходе около 1 % 5’-гидроксильных групп первого нуклеозида окажутся не связанными со вторым нуклеозидом.

Таким образом, при присоединении третьего нуклеозидного звена в 1 % олигонуклеотидов будет пропущено второе звено. Чтобы исключить получение нецелевых последовательностей, непрореагировавшую гидроксильную группу блокируют ацетилированиемвприсутствии катализатора(2,6-лутидин,4,4диметиламинопиридин). Такая процедура называется кэпированием(рис. 53).Рис.

53. Реакция кэпированияФосфиттриэфирная связь, образовавшаяся на втором этапе между нуклеотидами, нестабильна и может разорваться в присутствии кислоты илищелочи. Поэтому фосфиттриэфир окисляют с помощью иодной смеси доболее стабильного пятивалентного фосфаттриэфира (рис. 54).Рис. 54. Окисление фосфиттриэфираДалее можно повторять весь цикл реакций с третьим по порядку нуклеозидом: детритилирование, присоединение, кэпирование, окисление(рис. 55). Все описанные операции проводят до тех пор, пока к растущей48цепи в соответствии с программой не присоединится последний нуклеозид. В итоге получается полностью блокированный, т.

е. содержащий всезащитные группы, олигонуклеотид, присоединенный к твердому носителю. На этой стадии носитель можно извлекать из реактора и обрабатыватьконцентрированным водным раствором аммиака для удаления постоянныхзащитных групп с олигонуклеотида и его отделения от носителя.Рис. 55. Общая схема синтеза олигонуклеотидов фосфитамидным меиодомЗаключительная стадия – отделение целевого продукта с заданной длиной и последовательностью от укороченных кэпированных продуктов.

Этолегко сделать при помощи препаративного электрофореза в полиакриламидном геле.Чтобы выход продукта был достаточно высок, эффективность присоединения нуклеотидов на каждом этапе должна быть не ниже 98 %. Эффективность контролируют спектрофотометрическими методами, определяяколичество удаляемых тритильных групп. Если, например, при синтезе 20звенного олигонуклеотида эффективность каждого цикла равна 99 %, то82 % (т.

е. 0,9920? 100 %) олигонуклеотидов будут иметь именно такуюдлину. Фирмы-изготовители коммерческих ДНК-синтезаторов обычногарантируют среднее значение эффективности присоединения 98 %.49I.1.10. Синтез геновСпособность химически синтезировать любые последовательностинуклеиновых кислот открывает возможности для синтеза генов, которыетрудно выделить из природных образцов. Кроме того, можно синтезировать гены, ранее в природе не найденные.Если химически синтезированную двуцепочечную ДНК предполагается использовать в качестве гена или его фрагмента, то каждую из ее цепейсинтезируют отдельно. Получить короткие гены (60–80 п.о.) техническинесложно: для этого просто синтезируют комплементарные цепи. В случаекрупных генов (> 300 п.о.) приходится применять специальные стратегии,поскольку эффективность каждого цикла химического синтеза никогда недостигает 100 %.

Чтобы решить эту проблему, синтетические двуцепочечные гены собирают из модулей – одноцепочечных фрагментов длиной от20 до 100 нуклеотидов.Рис. 56. Синтез генов из олигонуклеотидов путем лигированияОдин из способов конструирования синтетического гена заключается вполучении набора олигонуклеотидов длиной 20–60 нуклеотидов каждый сперекрывающимися концами (рис. 56). Нуклеотидные последовательностицепей задают так, чтобы концевые сегменты гена имели тупые концы. Каждый внутренний сегмент имеет выступающие 3’- и 5’-концы, комплементарные концам соседнего сегмента.

Характеристики

Список файлов книги