1625914757-8aba282c54d2a3a371a92e361d6fe93d (843812), страница 8
Текст из файла (страница 8)
После сборки гена остается сшить одноцепочечные разрывы с помощью ДНК-лигазы фага Т4.50Для получения полноразмерных генов другим способом тоже вначалесинтезируют специфический набор перекрывающихся олигонуклеотидовдлиной от 40 до 100 звеньев. При их комплементации происходит спаривание 6–10 3’- и 5’-концевых взаимно комплементарных нуклеотидов, амежду ними остаются большие бреши. Протяженность двуцепочечныхучастков достаточно велика, чтобы стабилизировать всю структуру. Брешизаполняют ферментативным путем с помощью ДНК-полимеразы I E.
coli,использующей 3’-гидроксильные группы для инициации репликации иодноцепочечные участки в качестве матрицы. Оставшиеся одноцепочечные разрывы сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (рис. 57).Рис. 57. Синтез генов из олигонуклеотидов при помощи ДНК-полимеразыБолее протяженные гены (>1000 п.о.) обычно собирают из двуцепочечных фрагментов, каждый из которых в свою очередь состоит из 4–6 перекрывающихся олигонуклеотидов (20–60 п.о.
каждый). Двуцепочечные51фрагменты последовательно соединяют друг с другом до образования полноразмерного гена.I.1.11. Полимеразная цепная реакцияПолимеразная цепная реакция (ПЦР) – получивший широкое распространение в молекулярной биологии метод, позволяющий добиться значительного увеличения концентрации определенных фрагментов ДНК, выделенной из биологического материала (амплификации ДНК). Общую схемуПЦР предложил К.
Маллис в 1984 г. Единственным требованием к информации о последовательности амплифицируемого ПЦР фрагмента ДНК является знание последовательности небольших участков, ограничивающихэтот фрагмент.Для проведения ПЦР необходимы следующие компоненты: ДНК-матрица, содержащая участок, подлежащий амплификации; два праймера, последовательность которых совпадает с последовательностью ДНК на 5’-концах обеих цепей амплифицируемого участка; термостабильная ДНК-полимераза, способная вести синтез ДНК притемпературе около 70 °C (часто используется ДНК-полимераза изThermus aquaticus – Taq-полимераза); дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dCTP, dGTP, TTP) и компонентыреакционного буфера, необходимые для работы ДНК-полимеразы.Типичная ПЦР состоит из 20–40 последовательных циклов, каждый изкоторых включает несколько стадий, проводящихся при разных температурах (рис.
58). На первой стадии (денатурация) реакционная смесь выдерживается при температуре 94–98 °C, что вызывает расхождение комплементарных цепей ДНК-матрицы. На второй стадии (отжиг праймеров)температура снижается, обычно до 50–65 °C; точная температура зависитот последовательности праймеров и на 3–5 °C ниже их температуры плавления. При этом образуются комплементарные связи между праймерами исоответствующими им последовательностями ДНК-матрицы. В ходетретьей стадии (элонгация) ДНК-полимераза ведет синтез с использованием в качестве затравки 3’-концы праймеров, связанных с ДНК-матрицей.Синтез идет до тех пор, пока ДНК-полимераза не достигнет конца ДНКматрицы или пока не начнется новая стадия денатурации.Таким образом, после первого цикла ПЦР из одной длинной молекулыдвухцепочечной ДНК получаются две молекулы-продукта.
В каждой изних одна из цепей ранее входила в состав исходной молекулы ДНК, а вторая цепь была синтезирована в ходе цикла ПЦР; эта вторая цепь корочепервой и несет на 5’-конце синтетический праймер. В начале второго цикла ПЦР на стадии отжига праймеры могут связываться как с исходнымицепями ДНК, так и с цепями, синтезированными в ходе первого цикла.52Рис. 58. Принцип полимеразной цепной реакцииВ первом случае продукты элонгации будут такими же, как и продуктыпервого цикла. Во втором случае одна из цепей ДНК-продукта, возникше53го после второго цикла, несет на 5’-конце синтетический праймер, но неограничена с 3’-конца, а вторая цепь была синтезирована в ходе второгоцикла ПЦР, несет на 5’-конце синтетический праймер, а с 3’-конца терминируется последовательностью, комплементарной другому праймеру. После третьего цикла начинают появляться двухцепочечные продукты, ограниченные с обоих концов последовательностями, идентичными или комплементарными последовательностям праймеров.
Нетрудно видеть, что сростом числа циклов такие продукты накапливаются в геометрическойпрогрессии, а более длинные – в арифметической, поэтому после 20–40циклов подавляющее большинство продуктов ПЦР идентично участкуисходной ДНК между последовательностями праймеров. Экспоненциальный рост накопления продуктов ПЦР поддерживается, как правило, до техпор, пока праймеры и dNTP присутствуют в достаточной для этого концентрации.I.2. БелкиБелки – класс биополимеров, выполняющих множество разнообразныхфункций.
Основу химической структуры белков составляют полипептиды– полимеры, построенные из остатков аминокислот. Простые белки состоят из одной или нескольких полипептидных цепей, сложные могут дополнительно содержать ионы металлов, пигменты, липиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, остатки фосфорной кислоты и пр.I.2.1. АминокислотыВ состав белков входят -L-аминокислоты, отличающиеся строениембоковой цепи или бокового радикала R (рис. 59).Рис. 59. Общая структура -L-аминокислотБоковые радикалы аминокислот, входящих в состав белков, приведенына рис. 60 (структура пролина приведена полностью).54Рис.
60. Структура природных аминокислотВ пептидах карбоксильная группа одной аминокислоты образует амидную связь с аминогруппой другой аминокислоты (рис. 61).55Рис. 61. Амидная связь в пептидахПродукт, образующийся при такой конденсации, называют дипептидом. Аналогично можно получить три-, тетра-, пентапетиды и прочиеолигопептиды и полипетиды. Как видно, пептидные цепи обладают полярностью: началом цепи принято считать амино-концевой аминокислотный остаток (со свободной -аминогруппой), концом – карбокси-концевой(со свободной -карбоксильной группой). Соответствующие концы цепипринято обозначать как N-конец и C-конец.Различают несколько уровней пространственной организации полипептидных цепей: вторичную, третичную и четвертичную структуры.Главной структурной единицей пептидной цепи является пептиднаясвязь. Атомы углерода и азота, образующие эту связь, а также карбонильный атом кислорода и атом водорода при амидном азоте лежат практически в одной плоскости.
Вращение относительно связи C–N существеннозатруднено из-за взаимодействия -системы карбонильной группы с неподеленной электронной парой атома азота (рис. 62).Рис. 62. Резонансная структура пептидной связиКак правило, данная частично кратная связь имеет трансконфигурацию. Конформацию пептидной цепи принято описывать припомощи двугранных углов , и (рис. 63).Рис. 63. Углы, описывающие конформацию пептидной цепи56В качестве нулевой точки отсчета принимается полностью заслоненнаяконформация, в которой = = = 0° (рис.
64). Очевидно, что в трансконформации значение угла всегда близко к 180°. Углы и , напротив,могут принимать значения от –180° до +180°. Используя значения этихуглов при каждом атоме C, можно получить точное описание пространственного строения полипептидного остова белка.C'OC'ONHHNNHCCRHRHNNHNRHRNOHCCHCC'OHOC'C'OCC'CC'HOOHРис. 64. Конформация пептидной связиРис.
65. Карта Рамачандрана для интерлейкина-10 по данным РСАЕсли области значений углов и отложить по осям на плоскости, тополученные координаты можно использовать для создания предложенныхГ. Рамачандраном карт, в которых каждому сочетанию углов соответствует определенное значение энергии для данного аминокислотного остатка(рис. 65). Из-за взаимодействия боковых цепей аминокислотных остатковмежду собой определенные сочетания и оказываются энергетическиневыгодными.
Карты Рамачандрана, таким образом, представляют собойраспределение энергетически разрешенных (тёмные) и запрещенных (белые) конформационных зон. Компактное расположение зон на таких кар57тах свидетельствует о том, что углы и взаимосвязаны. При анализеструктуры полипептидов оценивают попадание значений и для каждого аминокислотного остатка (точки) в соответствующие зоны на картахРамачандрана.Пространственная структура пептидных цепей в основном определяется нековалентными взаимодействиями.
В качестве основных типов такихвзаимодействий выделяют водородные связи, а также ван-дер-ваальсовы,электростатические и гидрофобные взаимодействия.Наблюдаемая конформация пептида определяется суммой всех взаимодействий. Она является энергетически наиболее выгодной, что и отражается «попаданием» соответствующих углов в разрешенные области конформационных карт Рамачандрана.I.2.2. Высшие уровни структуры белковI.2.2.1. Вторичная структураСуществует два основных мотива вторичной структуры белков. Это такназываемые -спирали и -складки.Рис. 66. Варианты изображения α-спиралиПри образовании -спирали (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
