1625914757-8aba282c54d2a3a371a92e361d6fe93d (843812), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Гибридизация называется прямой, когда на носителе иммобилизуется мишень. Наиболее простой вариант прямой гетерогенной гибридизации – дот-гибридизация, при которой мишень иммобилизуется наносителе в виде отдельных точек. При блот-гибридизации на носительпереносят нуклеиновые кислоты, предварительно разделенные при помощи гель-электрофореза. Для этого гель помещают на катионную полимерную мембрану и прикладывают напряжение в направлении, перпендикулярном плоскости геля.
Таким образом, блот-гибридизация дает дополнительную информацию об электрофоретической подвижности мишени, которая участвует в образовании комплекса с зондом. Гибридизация in situ,например в препаратах хромосом, также является вариантом прямой гетерогенной гибридизации.Иммобилизация зонда на носителе (обратная гибридизация) позволяетзначительно увеличить производительность метода молекулярной гибридизации. В этом случае приходится использовать более сложные вариантымечения зонда. Одним из таких вариантов является метод молекулярногомаяка (рис. 36). В состав метки в данном случае входят два молекулярныхостатка: флуоресцентный краситель и тушитель флуоресценции.
Если этимолекулы достаточно сближены, то в результате возбуждения красителявся энергия передается тушителю, краситель при этом не флуоресцирует.Если же расстояние между остатками велико, энергия возбуждения в основном расходуется в виде флуоресценции. Наличие в последовательностизонда комплементарных друг другу участков обеспечивает тушение флуоресценции в исходном состоянии. В специфическом гибридном комплексезонд «вытягивается» вдоль цепи мишени, что и позволяет регистрироватьфлуоресцентный сигнал.Современные технологии позволяют на обычном предметном стекледля микроскопии разместить десятки тысяч различных зондов.
Такие зондовые «матрицы» называют ДНК-чипами, или биочипами. Конструкциятакого чипа (набор зондов) также определяется конкретной задачей. Например, чип может быть предназначен для анализа препарата ДНК пациента одновременно на все известные заболевания, связанные с мутациямив ДНК, или для установления полной первичной последовательности анализируемой нуклеиновой кислоты.36Рис. 36.
Метод молекулярного маякаМетод молекулярного маяка также используется для детекции специфических гибридных комплексов при гомогенной гибридизации. Образование комплекса происходит в растворе, а измерение интенсивности флуоресценции позволяет провести количественную оценку содержания целевой мишени в образце.I.1.8. Установление первичной последовательности ДНКДля обозначения методов установления первичной последовательностибиополимеров существует специальный термин – секвенирование (от англ.sequence – «последовательность»).До середины 1970-х гг. секвенирование нуклеиновых кислот осуществлялось чрезвычайно трудоемкими методами.
Классический аналитическийподход к решению этой проблемы предполагает последовательное отщепление и идентификацию одиночных нуклеотидов с определенного концаисследуемой нуклеиновой кислоты.Рис. 37. Общий принцип метода Максама – ГилбертаЗначительный прогресс в секвенировании нуклеиновых кислот былдостигнут с появлением метода Максама – Гилберта. Идея метода заклю37чалась в селективной химической модификации содержащей 5’-концевуюрадиоактивную метку ДНК по каждому из четырех азотистых оснований вусловиях, когда каждая молекула ДНК в смеси повреждается не более одного раза (рис.
37). На первый взгляд получается невообразимо сложнаясмесь: для каждого положения данного азотистого основания в цепи имеются два фрагмента. Но наличие концевой метки позволяет регистрировать только один из двух образующихся фрагментов, а разделение фрагментов при помощи гель-электрофореза – расположить меченые фрагменты на геле строго по уменьшению длины.Подбор четырех селективных реагентов позволил бы получить четыренабора всех возможных разрывов цепи ДНК, при этом каждый разрыв указывал бы на положение того нуклеотида, чей селективный реагент былиспользован. Если бы удалось подобрать все четыре селективных реагента,результат электрофоретического разделения продуктов реакции с последующей засветкой рентгеновской пленки выглядел бы следующим образом:Рис.
38. Радиоавтограф геля после разделения смеси продуктов строго селективного расщепления ДНКПоследовательность исследуемой ДНК при этом считывается, начинаяс более коротких 5’-концевых фрагментов.К сожалению, азотистые основания химически довольно мало отличаются друг от друга. Поэтому удалось лишь подобрать реагенты, селективные к пуринам или к пиримидинам. В кислой среде нуклеозиды претерпевают гидролиз N-гликозидной связи. В случае пуриновых нуклеозидов этареакция протекает в 100 и более раз быстрее, чем в случае пиримидиновых.
Поэтому основной процесс, который происходит с ДНК в кислой сре38де – апуринизация. В качестве кислотного реагента в методе Максама –Гилберта обычно применяют 66 %-ю муравьиную кислоту. Но кислотнаяобработка сама по себе не приводит к разрыву цепи ДНК. В результатегидролиза N-гликозидной связи в цепи ДНК образуется апуриновый сайт(АП-сайт):Рис. 39. Кислотная апуринизация ДНКНепосредственное расщепление цепи ДНК достигается обработкой пиперидином. Пиперидин взаимодействует с альдегидной группой дегликозилированного остатка дезоксирибозы с образованием основания Шиффа,а также создает в растворе щелочную среду.
В этих условиях происходитотщепление модифицированного остатка дезоксирибозы в виде 1-(4оксопент-2-енилиден)пиперидиния. В месте разрыва при этом остаются 3’фосфат с одной стороны и 5’-фосфат – с другой. В результате получаетсянабор фрагментов специфического расщепления по А и G.Рис. 40. Разрыв АП-сайта под действием пиперидина: образование основания Шиффа39Рис.
41. Разрыв АП-сайта под действием пиперидина: элиминация по основанию ШиффаОтличить фрагменты, полученные расщеплением только по G, позволяет селективная реакция с диметилсульфатом с последующей обработкойпиперидином.OOO P O-NOOCH3O P O-NHONNHONOHHHOHNNH2OHOHHH3CO S OCH3O P O-ONH2OHH-OOO CH3OOO P O-CH NNHOONOHHHNHO P OOO P O-NOHHHNHOHNH2NHHHHOHO P O-O P O-OON+Рис. 42.
Реакция гуанина с диметилсульфатомПри помощи обработки ДНК гидразингидратом можно селективно модифицировать пиримидиновые азотистые основания. Последующая обработка пиперидином приведет к разрыву цепи ДНК в месте модификации.Отличить расщепление по Т от расщепления по С можно, подавив реакцию с гидразингидратом по Т в щелочных условиях.40Рис. 43. Реакция пиримидинов с гидразингидратомТаким образом, реальные радиоавтографы, полученные по методуМаксама – Гилберта, выглядят так:Рис.
44. Радиоавтограф геля после разделения смеси продуктов расщепления ДНК при секвенировании по Максаму – Гилберту41К сожалению, селективность используемых реакций далека от абсолютной. Именно этот факт ограничивает производительность метода Максама – Гилберта. За один эксперимент можно секвенировать последовательность длиной около 100 нуклеотидов. Но большинство биологическихобразцов ДНК значительно длиннее. Проблема фрагментации ДНК длясеквенирования обычно решается с помощью специфичных ферментов –эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз).
Довольно большая группа этихферментов узнаёт короткие последовательности двуцепочечной ДНК (4–6нуклеотидов) и расщепляет обе ее цепи. Используя два или более фермента с различной специфичностью, можно получить наборы перекрывающихся фрагментов ДНК (блоков). Далее полученные фрагменты секвенируют, а затем по перекрыванию последовательностей фрагментов определяют последовательность исходной ДНК.
Такой метод секвенированиябиополимеров называется блочным.Почти одновременно с методом Максама – Гилберта был разработанметод Сэнгера, основанный практически на том же принципе. Так же как ив первом методе, для анализа последовательности необходимо получитьнабор фрагментов исследуемой молекулы, специфически оборванных поместу расположения в цепи определенного азотистого основания. По методу Сэнгера такие фрагменты получают с помощью фермента ДНКполимеразы (см. разд. «Репликация ДНК»).
При обычных условиях ДНКполимеразы по имеющейся цепи ДНК синтезируют новую цепь, комплементарную исходной. Субстратами этой реакции являются дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) – dATP, dGTP, dCTP и TTP. Соответствующие им2’,3’-дидезоксинуклеозидтрифосфаты (ddNTP) также могут выступать вроли субстратов ДНК-полимераз, так как их структура очень мало отличается от структуры обычных dNTP:Рис. 45. 2’,3’-дидезокситимидинтрифосфатОднако, включаясь в растущую цепь ДНК, дидезоксинуклеотиды останавливают ее дальнейший синтез по причине отсутствия 3’-гидроксильнойгруппы, необходимой для присоединения следующего нуклеотида. Если вреакционную смесь добавить небольшое количество одного из ddNTP,например ddATP, то в результате полимеризации будет получен наборфрагментов ДНК, статистически оборванных в месте расположения аденозина.
Проведя аналогичные реакции с добавлением каждого из оставшихся42ddNTP и разделив полученные фрагменты электрофорезом в геле, можно,как и в случае метода Максама – Гилберта, читать последовательностьсинтезированной ДНК прямо по радиоавтографу (очевидно, что полученная в данном случае последовательность комплементарна исследуемойцепи ДНК).Рис. 46. Радиоавтограф геля после разделения смеси продуктов синтеза ДНК при секвенировании по СэнгеруДНК-полимеразы не могут начать синтез «с нуля». В природе начальный участок новой цепи – праймер – синтезируется другим ферментом.Для секвенирования по методу Сэнгера используют заранее подготовленные праймеры, которые гибридизуют с исследуемой ДНК перед началомреакции полимеризации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
