1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 58
Текст из файла (страница 58)
17), необходимых для их полноценной экспрессии.12.5. Клонирование генов. ВекторыДля выделения нужного фрагмента ДНК в препаративных количествах его необходимо встроить в плазмиду — вектор, вскрытуютой же рестриктазой, которую использовали для получения рестриктов геномной ДНК. В качестве векторов служат плазмиды, несущие316 #Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмов?хРис. 12.7.
Структура плазмиды pBR322.На внешнем круге показаны различные сайты рестрикции (цифры — единицы измерения молекулярной массы в 1 х 1 0 5 Д), на внутреннем — расстояния в тысячах парнуклеотидов. Арг и Тсг — устойчивость к ампициллину и тетрациклину соответственно,0R I — начало репликациигены устойчивости к антибиотикам. На первых этапах развития генной инженерии применяли естественные плазмиды Е. coli, напримерPsllOl или C olEl. В настоящее время работают с искусственнымирекомбинантными плазмидами, несущими два или три гена устойчивости, которые содержат по одному уникальному сайту рестрикциидля какой-либо рестриктазы. Это плазмиды pBR322, 324, 325 и др.Например, широко распространенная плазмида pBR322 (рис.
12.7)несет гены устойчивости к ампициллину (Арг) и тетрациклину (Тс?).В гене Арг находится уникальный сайт для рестриктазы P stl, а в генеТ<? — для BamHl. Вскрывая вектор pBR322 по сайту BamHl в генеТсг, в него можно встроить фрагменты, полученные при помощи тойже рестриктазы за счет взаимодействия липких концов. Ковалент-Глава 12. Клеточная и генная инженерия317ное соединение вектора и клонируемого фрагмента завершает ДНКлигаза in vitro.Если теперь трансформировать клетки компетентной культуры Е.
coli плазмидой pBR322 со встроенным в нее фрагментом, тотрансформантов можно отобрать на среде с ампициллином. Далеенеобходимо их проверить по признаку устойчивости к тетрациклину. Если исходная клетка была трансформирована интактной плазмидой — без вставки фрагмента, то трансформант будет устойчивк тетрациклину так же, как и к ампициллину. Если же трансформация была осуществлена плазмидой со вставкой фрагмента в ген 7сг,трансформант должен быть чувствителен к тетрациклину, посколькуген Тс1оказался разорван и инактивирован вставкой.Далее клонируемый фрагмент ДНК может быть неограниченноразмножен в ходе клеточных делений трансформанта. Векторы типаплазмиды pBR322 называют векторами инактивации.Широко применяют также векторы на основе бактериофага X.
Известно, что средняя часть генома А,не существенна для его литическогоразмножения в Е. coli и может быть заменена на чужеродный фрагментДНК. Если размеры получаемой при этом ДНК не превышают предела (не более чем на 10 %), допустимого для упаковки в частицу фага,то образуются фаги с чужеродными фрагментами ДНК.
В этом случаеклонируемый участок ДНК хранят в виде частиц бактериофага илив виде клона бактерии с интегрированными гибридными профагами.Существует множество типов векторов, сконструированных на основе различных плазмид и различных бактериофагов. Не всегда удаетсяполучить фрагменты ДНК с липкими концами.
Эти концы могут быть«пришиты» к фрагментам ДНК искусственно, если ДНК полученапри помощи рестриктазы, образующей «тупые» концы, или в результате гидродинамической фрагментации. Одну цепь таких молекул ступыми концами наращивают за счет олигодезокси-А, а другую — засчет олигодезокси-Т при помощи нуклеотидилтрансферазы.Тупые концы наращивают также за счет синтетических линкеров — последовательностей, «узнаваемых» определенной рестриктазой или несколькими из них (рис. 12.8). После обработки соответствующей рестриктазой концы становятся липкими и фрагментможно встроить в вектор, вскрытый той же рестриктазой.12.6. Банки геновРассказывая о клонировании фрагмента ДНК, мы подразумевали, что нам доступен искомый ген или известна молекулярная массафрагмента, который можно извлечь из электрофореграммы рестрик-318 $Часть 2.
Разнообразие и единство генетических механизмовтов ДНК. В действительностидля получения нужного геначаще всего необходимы поиски,Фрагментацияи порой достаточно сложные.♦Для этого геномную ДНК, разEcoRIрезанную выбранной рестриктаПрисоединениезой, смешивают с ДНК вектора,EcoRI - линкерапппттшппттпп вскрытого той же рестриктазой*по уникальному сайту. В результате взаимодействия липкихРасщепление EcoRIконцов и последующего лиги*рования получают смесь рекомбинантных ДНК.
После этогополученные плазмиды со вставСоединение липких концовками различных участков ДНКнеобходимо расклонировать.Для этой цели описаннымспособом проводят трансформацию Е. coli. Поскольку трансформацию осуществляют смесьюплазмид с разными вставками,Рис. 12.8. Использование синтетическихлинкеров для образования липких концовто различные клетки в результате трансформации получати встраивания фрагмента в векторразные фрагменты клонируемойДНК.
Следовательно, на этом этапе нужно собрать как можно больше клонов трансформантов, чтобы быть уверенным в том, что искомый ген находится в одном из клонов. Так создают банки генов,или библиотеки генов, порой состоящие из десятков и сотен тысячклонов трансформантов.Размеры банка, необходимые для полного клонирования того илииного генома, можно определить, зная молекулярную массу генома(М), средний размер клонируемого фрагмента (т) и задавая определенную вероятность (Р) того, что клонирован весь геном.
Тогда объем банка, т. е. число клонов (N), равен:N =M/mln(l-P).Для некоторых объектов размеры банков генов представлены втаблице 12.2.Теперь можно приступить к поискам интересующего нас гена.Если проклонирован геном Е. coli, то процедура сводится к «наработке» клонированных фрагментов ДНК и проверке их способноститрансформировать соответствующие мутанты Е. coli. При этом неКлонируемая ДНКДНК вектораГлава 12.
Клеточная и генная инженерия'Ss 319Таблица 12.2Размер банка генов (АО разных организмов, содержащего искомый ген с различнойвероятностью (Р) (из Н. И. Матвиенко, по Clarke a. Carbon, 1976)И сто ч н и к Д Н КБ ак тер и я — Е. coliДрож ж и —М олекулярнаям а с с а (Д )ДНК, МС ред н и йр азм ерф р агм ен та М2,8 х Ю91 х 10'°8,5 х Ю61х ю 71,1 х Ю "2 х Ю12NРазмер банка при Р, равном:0,900,950, 9972094014402300300046001 х Ю723 00030000460001 х Ю7460000600000920000S. cerevisiaeД р о зо ф и л а —D. melanogasterК р о л и к — Orictolagus cuniculusобходимо иметь достаточно стабильный реципиент для трансформации, т. е. частота его ревертирования по заданному гену должна бытьзначительно ниже частоты трансформации. Кроме того, используемая в работе рестриктаза могла инактивировать искомый ген, если внем был соответствующий сайт рестрикции.
Поэтому может потребоваться повторение всей процедуры с другой рестриктазой. Общаясхема эксперимента по клонированию геномной ДНК представленана рисунке 12.9. На практике применяется неполное перевариваниегеномной ДНК одной или смесью двух рестриктаз.12.7. Трансформация эукариотЗначительно сложнее отыскать какой-либо ген в банке геновD. melanogaster. Для этого лучше всего точно знать, что представляет собой генный продукт. Если это фермент, то следует выяснить,какую реакцию он контролирует. Если ген экспрессируется в клетках Е. coli, что маловероятно (см.
гл. 16 и 20), то можно считать, чтоэкспериментатору повезло. В этом случае искомый ген идентифицируют по способности компенсировать соответствующий дефект метаболизма у мутанта Е. coli.Поскольку гены эукариот обычно не экспрессируются в клеткахпрокариот, прибегают к иным методам. Используют иммунохимические методы, в частности моноклональные антитела, если белок(генный продукт) доступен и им можно иммунизировать животных.Для идентификации клонов, несущих исследуемый ген, можно использовать метод гибридизации ДНК-ДНК или ДНК-РНК с использованием меченных радиоактивными изотопами или какой-либофлуоресцентной меткой ДНК-зондов.320 $Часть 2.
Разнообразие и единство генетических механизмовPstlPstlГеномная ДНКPstlIPst I - фрагментыОбъединениепо липким концамЛигированиеи трансформация E.coliIE .c o liВысев на средус тетрациклиномПроверка на средес ампициллином.Размножение клоновтрансформантов Те'Ар(банк генов)Рис. 12.9. Общая схема получения банка генов на основе плазмиды pBR 322Отбирают колонии трансформантов, сохранившие устойчивость к тетрациклину, ноутратившие устойчивость к ампициллинуПри поисках определенного фрагмента в банке генов лучше всегоидентифицировать его по способности трансформировать соответствующие мутанты того организма, геном которого был клонирован.Глава 12. Клеточная и генная инженерияФ321При трансформации эукариот при помощи ДНК бактериальныхплазмид необходимо учитывать, что репликаторы бактерий и ихплазмид не работают в клетках эукариот.
Вследствие этого такаятрансформация низкоэффективна. Для того чтобы возник стабильный трансформант, необходимы два последовательных события: проникновение ДНК в клетку и ее рекомбинация с хромосомной ДНК,т. е. интеграция. Такую интегративную трансформацию легче провести у эукариотических микроорганизмов, для которых доступныметоды селективных сред, чем у многоклеточных эукариот. Именно так были проведены первые эксперименты по трансформациидрожжей S.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
