1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 60
Текст из файла (страница 60)
Так,экспрессия в растениях (например в моркови) генов, кодирующихинтерферон или белки-иммуномодуляторы животных и человека позволяет создавать сорта — источники кормовых или пищевых добавок, обогащенных лекарственными препаратами.12.9. Рестрикционное картирование и секвенированиеУстановление точек действия различных рестриктаз позволяетпроводить физическое картирование участков молекулы ДНК и небольших геномов (плазмид вирусов).
Распределение сайтов рестрикции представляет собой своеобразный паспорт каждого фрагментаДНК и может быть использовано для его идентификации. Принципрестрикционного картирования сводится к получению перекрывающихся по размеру фрагментов, которые разделяют при помощиэлектрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.
Молекулярную массу фрагментов обычно определяют, используя в качестве «свидетеля» ДНК известного размера. На электрофореграммерестрикты-фрагменты ДНК различают, окрашивая их бромистымэтидием и просматривая гель в ультрафиолетовом свете. Применяюттакже радиоактивное мечение концов фрагментов с помощью полипуклеотидкиназы фага Т4.Непосредственно для картирования сайтов рестрикции используют метод неполного гидролиза одной рестриктазой или метод нескольких, чаще всего двух рестриктаз. В случае неполного гидролиза молекулы, имеющей, например, два сайта рестрикции, будутполучены пять фрагментов — пять полос при электрофорезе плюсеще одна полоса интактных молекул (рис.
12.13, А). В простейшемслучае по распределению молекулярных масс удается определитьвзаимное расположение фрагментов. Можно также извлечь из геляпродукты неполного гидролиза и еще раз подвергнуть их действиюрестриктазы. Если при этом (см. рис. 12.13, А) освобождается общий фрагмент В, то общее расположение фрагментов определяется:АВС.При использовании двух рестриктаз ДНК гидролизуют каждойрестриктазой по отдельности и обеими рестриктазами вместе. Предположим, что одну и ту же молекулу одна рестриктаза режет на дваГлава 12. Клеточная и генная инженерш#327А В СА ——А —АВ—С—jВ |СРестриктаза IIА ^ ^В—СV——При полномгидролизе ДН КAРестриктаза IРаспределение полосна электрофореграммепри неполномгидролизе ДНК\!|в—с—А—В —С —А—В—В'1+х 11А' —В’ —С——абВ_Рис.
12.13. Физическое картирование молекулы ДНК методом неполного гидролиза(А) и методом двух рестриктаз (Б) (по Н. И. Матвиенко, 1979)Фрагменты А, В, С образуются при действии рестриктазы I; А’, В’ — при действиирестриктазы IIфрагмента, а другая — на три (рис. 12.13, Б). При совместном ихдействии исчезает фрагмент В и появляются два новых, по молекулярной массе в сумме составляющих исчезнувший фрагмент. Такимобразом, сопоставляя размеры фрагментов, выявляемых на электрофореграммах а, б, в, определяют их взаимное расположение: АВС.Если физическое картирование проведено для участка генетического материала, маркированного мутациями с известным расположением, то рестрикционную (физическую) и генетическую картыможно ориентировать относительно друг друга (см.
гл. 16).Революционизирующее значение для работы с генетическим материалом имели методы определения первичной структуры, или секвенирования ДНК (от англ. sequence).Современные методы секвенирования (метод химической деградации ДНК Максама-Гшберта и метод синтеза ДНК на матрице вприсутствии терминаторов синтеза Сэнгера) в своей основе разработаны в 1977 г. Идея методов состоит в следующем.1. Получение серии меченных радиоактивными изотопами (иликаким-либо иным способом) полинуклеотидов с одним фиксированным концом и заканчивающихся по одному из четырех нуклеотидов.2. Электрофорез полученных меченых фрагментов в денатурирующем полиакриламидном геле с высокой разрешающей способно328 ФЧасть 2.
Разнообразие и единство генетических механизмовстью, позволяющей разделять полинуклеотиды, отличающиесяна один нуклеотид.3. Выявление положения меченых фрагментов с помощью радиоавтографии или флуоресцентной метки.Секвенирование олигонуклеотидов по методу МаксамаГилбертаВ качестве примера определим первичную структуру однонитевого декануклеотида:5'-GATCATCAGG-3'.Метить радиоактивным изотопом фосфора 32Р удобнее с помощью фермента полинуклеотидкиназы фага Т4 и 32Р уАТФ:полинуклеотидкиназа5'декануклеотид-З'ОН + 32Р уАТР ------►5' 32Р-декануклеотид-3'ОН.Затем меченую ДНК делят на четыре порции и подвергают химическому гидролизу в таких условиях, чтобы в среднем на одну молекулу пришелся один разрыв в специфическом сайте.
В разработкетаких специфических реакций большая заслуга принадлежит академику Е. Д. Свердлову. Эти реакции состоят из этапов модификациинуклеотидов и разрыва ДНК в месте модификации (рис. 12.14, А).В результате этих реакций в пробах будут появляться наборымеченых олигонуклеотидов (рис. 12.14, Б). Продукты реакций подвергают электрофорезу в денатурирующем полиакриламидномгеле, и получают радиоавтограф геля на рентгеновской пленке. Приэтом следует помнить, что скорость миграции фрагментов обратнопропорциональна их длине.
С учетом этого прямо с радиоавтографасчитывают нуклеотидную последовательность (рис. 12.14, Б, справа). На одном геле можно прочитать последовательность длиной в200-300 п. н.При помощи метода Максама-Гилберта можно секвенироватькак однонитевую, так и двунитевую ДНК, так как меченый с одного конца двунитевой фрагмент ДНК несет метку только с 5'-концаодной нити ДНК. Стратегия секвенирования длинных (> 1000 п. н.)фрагментов ДНК состоит в следующем.1.
Выделение препаративного количества ДНК исследуемого фрагмента.2. Расщепление этого фрагмента на более мелкие с помощью эндонуклеаз рестрикации и мечение образовавшихся концов (спомощью полинуклеотидкиназы и 32Р уАТФ или при застройке«липких» концов большим фрагментом ДНК-полимеразы I, со-329Глава 12. Клеточная и генная инженерияРеакция “G”(модификациягуанина)Реакция “G+A”(модификацияаденина или гуанина)Реакция “Т+С”(модификациятимина или цитозина)Реакция “С”(модификацияцитозина)32Р-ДНК32Р-ДНК32Р-ДНК32Р-ДНК+диметилсульфат++муравьиная кислота+пиперидинпиперидинЭЛЕ КТР ОФ О РЕЗGGGАСТАСТАGВДЕ Н А ТУ Р И Р У Ю Щ Е МР—GATCATCAGG(IO)NaCLпиперидинП О Л И А К Р И Л А М И Д Н О МG+A2P -G A TC A TC A G (9)+++гидразин+Т+СпиперидинГЕЛЕСР—G АТС AT CAGG ( 10)P -G ATC ATC AG (9)32 P_G АТС АТС A (8)P—GATCATC(7)2P—G ATCAT (6)P -G A TC A TC (7)P—GATCA(5)2P—GATC(4)32P-G A TC (4)2P -G A T (3 )P—GA(2)P -G (1 )2P—G(1}Рис.
12.14. Схема эксперимента по секвенированию фрагмента ДНК по методуМаксама-ГилбертаА — схема специфической химической модификации нуклеотидов в ДНК; Б — результат электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле и его интерпретации.Цифры в скобках — длина фрагментов, выраженная в числе нуклеотидовхранившим полимеразную, но не экзонуклеазную активность(см.
гл. 5) в присутствии нуклеозидтрифосфатов, один из которых мечен 32Р в a-положении). На этом этапе обычно получаютсяфрагменты, меченные с обоих концов, поэтому каждый меченыйфрагмент выделяют из геля и либо подвергают электрофорезу дляразделения цепей, либо гидролизуют еще одной рестриктазой дляполучения субфрагментов, несущих 32Р только с одного конца.3. Определение нуклеотидных последовательностей всех меченныхс одного конца фрагментов.Очевидно, данные процедуры достаточно трудоемки и на большинстве этапов приходится проводить тонкие манипуляции с радиоактивной ДНК, поэтому в настоящее время для определения нуклеотидных последовательностей длинных фрагментов ДНК применяютв основном метод Сэнгера.Для секвенирования ДНК по методу Сэнгера ее клонируют воднонитевых фагах.
Основа метода Сэнгера — синтез радиоактивных копий однонитевой ДНК от фиксированного олигонуклеотида-330 *Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовзатравки в присутствии нуклеотидспецифичных терминаторовсинтеза ДНК. Чтобы облегчить выделение однонитевых матриц,Дж. Мессинг сконструировал серию векторов на основе фага М13,содержащего в капсидах однонитевую ДНК. Биология размножения М13 чрезвычайно удобна для создания таких векторов.
М13реплицируется в клетке в виде двунитевой репликативной формы,которую можно легко выделить и использовать для клонированиячужеродной ДНК как обычную плазмидную ДНК. В то же времятакие рекомбинантные клоны выделяют и из суспензии зрелых частиц фага в однонитевой форме. Сконструированные Мессингомвекторы содержат полилинкер, т. е. последовательность, являющуюся мишенью для нескольких рестриктаз, для клонирования ДНКв области фагового генома, несущественной для его размножения;кроме того, при вставках чужеродной ДНК изменяется цвет фаговыхнегативных колоний (пятен лизиса на газоне бактериальной культуры) на среде с индикаторным красителем. Для секвенированияолигонуклеотид-затравку длиной 15-20 нуклеотидов ренатурируют(гибридизуют) с гомологичной областью фага М13, лежащей рядомс сайтом, в который встроена клонируемая чужеродная ДНК (рис.12.15, А).
Можно использовать меченую с 5'-конца затравку или вести синтез в присутствии одного меченого в a -положении нуклеозидтрифосфата. Комплекс матрица — затравка разделяют на четырепорции и наращивают затравку при помощи большого фрагментаДНК-полимеразы I Е. coli (см. гл. 5), всех четырех нуклеозидтрифосфатов и одного, специфического для данной порции, терминатора синтеза ДНК. В качестве последних обычно используют 3'-,5'-дидезоксинуклеозидтрифосфаты (ddNTP), которые могут включаться в ДНК, но препятствуют дальнейшему росту цепи.
В результате включения, например, ddATP вместо dATP в случайные местанапротив остатков тимина в матрице будет получаться набор меченых олигонуклеотидов с фиксированным 5'-концом и оканчивающихся на месте А.Продукты реакции элонгации с ddGTP, с ddATP, с ddCTP и ddTTPденатурируют и разделяют электрофоретически, как описано дляметода Максама-Гилберта. При авторадиографии получают наборполос, читаемый так же, как набор полос при использовании метода Максама-Гилберта. Обычно реакции элонгации занимают около30 мин, что более чем в 6 раз быстрее реакций химической деградации. Скорость накопления информации при этом методе привела кпоявлению метода секвенирования длинных последовательностей,образующихся в экспериментах типа «shot gun» {дробовика). ПриГлава 12. Клеточная и генная инженерияФ 331Клонируемая ДНКОлигонуклеотидзатравка5'Р5ddAА Т GCATTAЗатравка53ATG CATTATACG TddAATGCA Т ТАTACGTA ddAATGCAT Т АРис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
