1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 59

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 59)

cerevisiae. Для этого дрожжевой ген LEU2, кодирующийу3-изопропилмалатдегидрогеназу, был вставлен в бактериальнуюплазмиду ColEl и проклонирован в Е. coli. Этот ген S. cerevisiae экс­прессируется в Е. coli, компенсируя аналогичный метаболическийдефект бактерии. Сферопласты дрожжей (клетки, лишенные обо­лочки) трансформировали плазмидной ДНК. Реципиентом служилштамм, несущий стабильную мутацию 1еи2. Частота трансформацииLeir —>Leu+составляла 1 х 10-6 на регенерирующий сферопласт, т. е.на число клеток, которые вновь восстановили свою оболочку.Повысить эффективность трансформации на два порядка удалосьс использованием так называемой челночной, или гибридной, плазми­ды, имеющей два репликатора: один — от ColEl (бактериальный),а другой— от дрожжевой плазмиды размером 2 мкм (см.

гл. 11).В дальнейшем в таких челночных векторах использовали реплика­торы ДНК с контурной длиной 3 мкм (см. гл. 11) и участки ARS,обеспечивающие репликацию хромосом (см. гл. 5). Такие векторымогут реплицироваться как в Е. со И, так и в S. cerevisiae. Повышениеэффективности трансформации такими эписомными векторами со­провождалось высоким уровнем нестабильности трансформантов.При клонировании трансформантов в неселективных условиях 70-80 %клеток теряли плазмиду и, соответственно, вновь становились ауксотрофными по лейцину. Находясь в клетке, такие эписомные векто­ры могут интегрировать с хромосомной ДНК.Генно-инженерное конструирование у дрожжей пошло по путисоздания кольцевых плазмид с центромерами, а затем искусствен­ных мини-хромосом, имеющих центромеру, теломеры и репликато­ры (см.

гл. 5). Таким образом, трансформацию эукариот облегчаетсоздание векторов с репликаторами, специфичными для трансфор­мируемого объекта. Так, высокая эффективность трансформацииD. melanogaster по гену r y — rosy (у мутантов дефектна ксантиндегидрогеназа и глаза приобретают коричневатый цвет) была до11—Инге-Вечтомов322 «?Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовстигнута путем введения доминантной аллели гу+в один из мигри­рующих элементов — Р, который представляет собой часть системыгибридного дисгенеза (см.

гл. 11). От 20 до 50% потомства мух, ко­торым инъецировали такую ДНК в гениальные клетки, оказалисьтрансформантами гу+.Для клонирования генов и трансформации клеток животных пер­спективными векторами служат вирус SV40 и вирус папилломы. Этивирусы вызывают злокачественные опухоли у грызунов.

Кроме того,SV40 может заражать клетки обезьян и человека. Некоторые участкиДНК этих вирусов могут быть делегированы без потери инфекционности и замещены фрагментами чужеродной ДНК. Эти участки достаточ­но большие, их масса может достигать 3,3-3,5 МД (мегадальтон). Такиевекторы применяют для клонирования генов в клетках животных.В настоящее время интенсивно работают над созданием искус­ственных хромосом млекопитающих, однако эта работа встречаетзатруднения, связанные со сложным строением центромеры и кине­тохора, а также репликаторов высших эукариот.12.8. Генная инженерия в природе и векторы дляклонирования генов растенийОпухолевое заболевание растений, известное как корончатыйгалл (рис.

12.10, см. цветную вклейку), описал еще Аристотель. В на­чале XX в Е. Смит и К. Таундсен (1907) показали, что это заболева­ние вызывает почвенная бактерия. Выделенная в виде чистой куль­туры Agrobacterium tumefaciens способна приводить к образованиюопухолей у некоторых представителей голосеменных и большин­ства двудольных покрытосеменных растений. Клетки растительныхопухолей интенсивно растут на искусственных средах и при этомне нуждаются в добавлении фитогормонов в отличие от клеток нор­мальных тканей.В 70-х годах XX в.

выяснилось, что причиной опухолеобразования являются так называемые 77-плазмиды, обнаруженные в клеткахнекоторых штаммов A. tumefaciens. П-плазмиды — это кольцевыемолекулы ДНК размером 50-80 мкм с молекулярной массой около1,3 х 108 Д длиной до 200 тыс. п.

о. Эти плазмиды проникают избактерий в клетки растения, и часть ДНК 77-плазмиды, так называе­мая Т-ДНК, ковалентно встраивается в хромосомы инфицируемогорастения. Будучи интегрирована с хромосомой, Т-ДНК вызывает об­разование опухоли, гиперпродукцию фитогормонов: цитокининови индолилуксусной кислоты (ауксина), а также синтез ряда произ-Глава 12. Клеточная и генная инженерияАБTi-плазмидаВФ323ГТ-ДНКХромосомаХромосомная'ДНК /Т-ДНКA. tumefaciensТрансформированнаяAgrobacteriumрастительная клеткаКорончатыйгаллtumefaciensРис. 12.11.

«Генетическая колонизация» высшего растения бактерией A. tumefaciens(по М.-Д. Хилтон, 1983)A — A. tumefaciens существует в ризосфере растения; Б — в клетках бактерии нарядус хромосомой содержится 77-плазмида; В — Г/'-плазмида проникает в клетку растенияи Т-ДНК встраивается в геном растения; Г — это приводит к образованию опухоли исинтезу опиновводных аминокислот, объединяемых под общим термином опины.Опухоль возникает вследствие нарушения баланса фитогормонов, откоторого зависит нормальный морфогенез растения. Опины, выделя­емые клетками опухоли, бактерия использует в качестве источниковуглерода и азота, причем только в том случае, когда A. tumefaciensсодержит 77-плазмиду, заразившую клетки растения (рис.

12.11).77-плазмида относится к классу конъюгативных плазмид, т. е. мо­жет передаваться в клетки A. tumefaciens, лишенные ее. Этот про­цесс эффективно происходит в зараженном растении и стимулиру­ется опинами.Описанные здесь взаимоотношения A. tumefaciens и высше­го растения Дж. Шелл назвал генетической колонизацией, котораяпредставляет собой эксперимент по генной инженерии, поставлен­ный самой природой. Таким образом, 77-плазмида— это природ­ный вектор для трансформации клеток высших растений.

Как по­казал Дж. Шелл, если из клеток корешков табака с интегрированнойТ-ДНК получить культуру (каллус) растительной ткани, а затемцелые растения-регенеранты, то при последующем генетическоманализе признак «присутствие Т-ДНК» обнаруживает менделевскоенаследование.В качестве векторов для клонирования генов и последующейтрансформации растений используют две разновидности 77-плазмид.и*324 &Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовОктопинНопалинРис. 12.12. 77-плазмиды (по Дж. Шеллу, 1983)А — октопиновая; Б — нопалиновая.Гомологичные участки (a-d) заштрихованы. Показаны гены синтетаз: Ocs — октопина,Nos — нопалина; катаболизма: Arg — аргинина, Осс — октинина, Agr — агропина,Аде — агроцинопина; Тга — функции переноса при конъюгации, Inc — несовмести­мость с другими плазмидами, Ori — начало репликацииОни различаются по типу опинов (<октопины или нопалины), ко­торые синтезируют зараженные ими растения (рис.

12.12). Клони­руемый ген встраивают вместо кодирующей части генов октопинсинтетазы или нопалинсинтетазы, входящих в состав Т-ДНК. Дляклонирования гена в бактерии, обычно Е. coli, конструируют ги­бридные плазмиды. После заражения растения плазмидой ее Т-ДНКсо встроенным геном интегрирует с хромосомной ДНК. В качествепотенциальных векторов для переноса генов рассматривают такжемногочисленные вирусы и транспозоны растений.В настоящее время не только выделены и проклонированы инте­ресные с практической точки зрения гены высших растений, контро­лирующие запасные белки сои, ячменя, гороха, кукурузы, а такженекоторые гены, контролирующие активность ферментов: алкогольдегидрогеназы и каталазы кукурузы, а-амилазы ячменя и т.

д., но иГлава 12. Клеточная и генная инженерияФ 325полностью клонированы и секвенированы геномы Arabidopsis, риса,ячменя.Первыми чужеродными генами, введенными в начале 80-х годовXX века в высшие растения, были гены устойчивости к антибиоти­кам из Е. coli. Затем, в клетки табака был передан ген устойчивостик метотрексату — ингибитору дигидрофолатредуктазы. В табакбыл введен также ген дрожжей, кодирующий алкогольдегидрогеназу.Этот ген устойчиво наследовался в мейозе у растений-регенерантов,полученных из каллусной ткани, но не экспрессировался в клеткахрастений. Ген, кодирующий Р-глобин кролика, удалось интегриро­вать в геном табака.

Он устойчиво наследовался в культуре каллус­ной ткани, но опять же не экспрессировался.В клетки подсолнечника с помощью 77-плазмиды был передан генфазеолина бобов. Фазеолин — это гликопротеин, составляющий до50% запасного белка бобов. Будущее растение, полученное первона­чально в виде каллусной массы, получило наименование санбин (отобъединения англ.

названия подсолнечника — sunflower и бобов —bean). Тот же ген фазеолина введен в табак и получены растениярегенеранты, синтезирующие менее 1 % фазеолина от общего белкарастения. Были получены растения табака, которые светятся в тем­ноте благодаря экспрессии в них гена люциферазы светлячка.В опытах по генной инженерии растений экспериментаторывстречают некоторые специфические проблемы.

Среди них — такназываемая сомаклоналъная изменчивость, множественная инте­грация переносимых генов и замолкание (отсутствие экспрессии)самих переносимых генов или генов реципиента, имеющих гомоло­гичные последовательности нуклеотидов.Сомаклональная изменчивость представляет собой результат нако­пления изменений при культивировании каллусной ткани. Эти изме­нения представляют собой как мутации (см. гл. 13-15), так и эпигене­тические изменения (см. гл.

18), проявляющиеся у регенерантов.Множественная интеграция переносимых векторных молекулсвязана с тем, что в клетку проникает несколько молекул вектора иони встраиваются в геном реципиента не на основании гомологич­ной рекомбинации, т. е. классического кроссинговера или конвер­сии, а на основании незаконной или негомологичной рекомбинации(см. гл. 7) в разные участки генома.Часть встроенных копий трансгена или все они могут не экспрес­сироваться. Это явление замолкания, или так называемого сайленсинга (от англ.

silence — молчание, тишина), механизм которого недо конца расшифрован.326 *Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовНесмотря на некоторые нерешенные проблемы, уже сейчас ме­тодами генной инженерии успешно получают растения, устойчи­вые к гербицидам и вирусам, растения с индуцированной мужскойстерильностью, устойчивые к насекомым-вредителям сельского хо­зяйства и др. Особого внимания заслуживает создание трансгенныхсортов — живых вакцин для целей ветеринарии и медицины.

Характеристики

Список файлов книги