1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 56
Текст из файла (страница 56)
Это трудно осуществить при обычных способах гибридизации и расщеплении (см. гл. 15). Обилие вариантов, возникающихпри мейотическом расщеплении, не поддается строгому контролюиз-за невозможности маркировать все хромосомы и участки рекомбинации.Элементы парасексуального цикла успешно используют длякартирования генов человека, контролирующих определенные этапы клеточного метаболизма. Очевидно, что человек — неудобныйгенетический объект, по меньшей мере из-за невозможности проведения у него гибридологического анализа в классической форме(подробнее см. гл. 22) по морально-этическим соображениям. Темне менее картирование его генов, особенно аномальных, диктуетсяпотребностями медицинской генетики.Глава 12.
Клеточная и генная инженерия307Соматические клетки одноговида животных, культивируемыена искусственных средах вне организма, оказалось возможнымгибридизовать не только междусобой, но и с клетками животныхдругого вида, например мыши икитайского хомячка (рис. 12.1).18Так же гибридизуют клетки че-Прловека и мыши.J*Мышь— объект, изученныйв генетическом отношении гораздо лучше, чем человек.
У неедоступно значительное числомаркеров по генам, контролирующим пути метаболизма. ГибридыГсоматических клеток получают,стимулируя их слияние воздей* '• « #ч«Лi ствием гемагглютинирующеговируса Сендай и полиэтиленглиi ‘V f e iколя. При этом гибридизация достигает 25-30% от общего числаклеток. На первой стадии возникают гетерокарионы, в которыхс частотой около 1 х Ю'4 сливаются ядра— образуются синкарионы. Если синкарион возникот слияния гетероплоидной (т.
е.с нерегулярным числом хромосом) и диплоидной клеток, то вдальнейшем он постепенно теряет хромосомы одного или обоихродителей.Рис. 12.1. Метафазные пластинки (фотоЕсли в хромосомах мышиТ. Н. Игнатовой, Т. М. Гринчук, Е. А. Сорокина) имеются рецессивные биохиА — фибробласта легкого китайскогомические маркеры (ауксотрофхомячка линии V-79RIK; Б — мышинойность, устойчивость и т. д.), тогепатомы линии МГ ХХПа; В — гибриднойизучают параллельно цитологиклетки, образовавшейся при их слиянии.ческие характеристики и биохиЦифры — номера хромосом. Стрелкимические признаки в процессеуказывают на хромосомы мышиклонирования гибридов.
Потеря&308 #Часть 2. Разнообразив и единство генетических механизмовопределенной хромосомы человека, сопровождаемая проявлениемрецессивного маркера мыши, указывает на локализацию гомологичного (более строго — ортологичного) гена в определенной хромосоме человека. Так, например, был впервые локализован структурныйген тимидинкиназы в 17-й хромосоме человека.Для отбора нужных клонов гибридных соматических клеток применяют селективные среды.
Для идентификации многих белков используют технику электрофореза, позволяющую различать гомологичные белки человека и мыши. Таким образом локализуют гены вопределенных хромосомах.Методы гибридизации соматических клеток, или парасексуальную гибридизацию, широко применяют и в генетике растений.В этом случае сливают не соматические клетки непосредственно, аих протопласты, предварительно лишенные оболочек, которые удаляют ферментативным путем. При этом способе гибридизации также удается преодолевать не только межвидовые, но и межродовыебарьеры нескрещиваемости.
Благодаря возможности получения недифференцированной массы растущих клеток — каллуса (рис. 12.2,см. вклейку) и последующей его дифференцировки получают целые гибридные растения. Однако при этом отдаленные гибриды невсегда способны к нормальному морфогенезу и часто оказываютсястерильными. Успех такого эксперимента тем менее вероятен, чемдальше в таксономическом отношении отстоят друг от друга скрещиваемые формы. На рисунке 12.3 (см.
вклейку) показан соматический гибрид между двумя крестоцветными: Arabidopsis thalianaи Brassica гара, названный автором (Ю. Ю. Глеба) Arabidobrassica.Такой соматический гибрид образует крайне аномальные побеги.Подобные «монстры» могут служить для изучения закономерностейморфогенеза и совместимости геномов различных видов. Наконец,многие отдаленные гибриды такого типа могут возникать только приискусственной гибридизации соматических клеток, но не при помощи естественного полового процесса.Соматическая гибридизация открывает большие перспективыдля получения нового исходного материала в селекции.
Созданысоматические гибриды культурного и дикого картофеля (,Solariumtuberosum х S. chacoense). Для декоративного цветоводства представляют интерес соматические гибриды между видами Petunia parodii иP. parviflora, которые половым путем не скрещиваются. Этот приемпозволил ввести в селекцию признак «разветвленный, стелющийсяпобег» от P. parviflora.
Получен соматический гибрид между капустой (Brassica oleracea) и турнепсом (В. campestris) и др.Глава 12. Клеточная и генная инженерия#309Для изучения закономерностей функционирования дифференцированных клеток пересаживают ядра из соматических клеток вэнуклеированные яйцеклетки животных. Образуют также гибридымежду раковыми и нормальными клетками.
Такой подход широкоприменяют при получении так называемых моноклональных антител на основе выращивания гибридом. Как известно, специфическиеантитела в ответ на введение в организм животного антигена (чащевсего чужеродного белка или полисахарида) вырабатываются определенными клонами клеток иммунной системы. Эти клетки, извлеченные из селезенки иммунизированного животного, сливают с клеткамимеланомы — одного из типов злокачественной опухоли. В результатеобразуются гибридомы, которые объединяют качества обеих родительских форм: от клетки иммунной системы — способность вырабатывать определенные антитела, а от клетки меланомы — способностьнеограниченно долго делиться в культуре (рис. 12.4).Разработка техники получения моноклональных антител позволяет получать в высшей степени специфичные реагенты, «узнающие»не просто тот или иной тип макромолекул, но и их индивидуальныеособенности. Это находит применение в медицине, промышленности, выпускающей ферментные препараты.Для исследования эпигенетически наследуемых признаков,проявляющихся при дифференцировке клеток и тканей проводятгибридизацию дифференцированных и недифференцированных —так называемых стволовых клеток.Удается не только слияние соматических клеток, но и реконструкцияцелых клеток из их отдельных компартментов.
Так, можно энуклеировать клетки млекопитающих, воздействуя на них цитохалазином В —веществом, которое вырабатывает гриб Helminthosporium dematioideum.Цитохалазин вызывает выталкивание ядер из клеток. В результате такой обработки образуются безъядерные клетки — цитопласты и свободные ядра, окруженные тонким слоем цитоплазмы, — кариопласты.Цитопласт можно сливать с нормальными клетками, получая ядерноцитоплазматические гибриды, или цибриды. Этот метод — аналог цитодукции для соматических клеток млекопитающих. Он позволяетизучать взаимоотношения ядерных и неядерных генов.
Таким способомбыла продемонстрирована митохондриальная природа устойчивости кхлорамфениколу у соматических клеток мыши.Свободные ядра и цитоплазму удается перекомбинировать упростейших и амфибий. Ядерные эритроциты птиц сливают с энуклеированными клетками млекопитающих при обработке вирусомСендай. Поскольку при таком воздействии эритроциты лизируются,310 »Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовКультура клетокмиеломыQо° оо ООО2 x 1 о7 клеток«ОООм иеломыС л и ян и е клетокв п рисутствиипол иэтиленгликол яО тбор гибридомв селективнойсреде♦В ы яв л ени е ги бри д о мп р о д уц и р ую щ и ха н ти тел аК л о н и р о в ан и еги бри д о мП р о в ерка ги б ри д о мна а кти в н о с тьс и н теза ан ти те лР а зм н о ж е н и екл он аЗамораживаниеги б р и д о мдля храненияРис.
12.4. Схема получения моноклональных антител на основе гибридом(по С. М. Гершензону, 1983)Глава 12. Клеточная и генная инженерия#311клетка фактически реконструируется из ядра эритроцита и цитопласта млекопитающего. В результате такого слияния ядро эритроцитаптицы (курицы), ранее неактивное, начинает функционировать в цитоплазме млекопитающего (мыши): синтезируется РНК, появляютсяядрышки, иногда наблюдается синтез ДНК. Правда, жизнеспособность таких реконструированных клеток сохраняется недолго —около трех дней. Получают и реконструированные клетки млекопитающих путем слияния карио- и цитопластов. Разработаны методымикроинъекций в клетки с помощью «теней» эритроцитов — мембран эритроцитов, лишенных содержимого, или так называемыхмембранных пузырьков — замкнутых фрагментов клеточной мембраны, а также других искусственных и природных носителей.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
