1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 57
Текст из файла (страница 57)
Используя подобные носители, в клетку можно вводить лекарства, красители и даже целые хромосомы.Эксперименты по реконструкции клеток используют как для изучения биологии клетки, так и для разработки новых методов терапиина клеточном уровне.12.3. Трансформация и генная инженерияОткрытие трансформации у бактерий и особенно идентификацияДНК как трансформирующего агента стимулировали попытки трансформации у животных, растений и эукариотических микроорганизмов.При этом попытки провести трансформацию с помощью препаратовтотальной геномной ДНК привели к противоречивым результатам.Только в конце 70-х годов XX в.
были получены воспроизводимые результаты с применением так называемой векторной трансформации.В основе этого подхода — использование векторных молекул, иливекторов, в качестве которых применяли плазмиды сначала бактериальных, а затем эукариотических клеток. Векторы — это молекулыДНК, способные переносить включенные в них гены в клетку, гдеэти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом. Решающую роль в этих экспериментах сыграли также методы получения индивидуальных генов в препаративных количествахпутем клонирования, т. е.
практически неограниченного размножения в бактериальных клетках. В ходе разработки этих процедурбыла создана мощная техника генной инженерии, включающая: выделение индивидуальных фрагментов ДНК любого происхождения,их стабильное воспроизведение в составе векторов, идентификацияклонированных таким образом генов, их изменение и введение вклетки организма исходного или иного вида. Эта техника, получившая также название техники рекомбинантной ДНК, в соединении312 #Часть 2.
Разнообразие и единство генетических механизмовс методами расшифровки первичной структуры генов, т. е. их нуклеотидной последовательности, сделала возможными эксперименты непосредственно на генетическом материале, манипулированиегенами в научных и практических целях.12.4. Получение геновПервый успешный эксперимент по выделению гена, а точнеегруппы генов лактозного оперона (см.
гл. 17) Е. coli был выполнен влаборатории Дж. Беквита (1969). Для этого использовали два трансдуцирующих бактериофага Хиф 80, включившие lac- оперон в своигеномы в противоположной ориентации по отношению к собственным генам (рис. 12.5). Напомним, что фаги X и ср 80 близки по структуре генома (см. гл. 10).У обоих фагов комплементарные цепи ДНК отличаются друг отдруга по плавучей плотности. Благодаря этому после плавления ДНК______ lac______Jа у z о р i№Лй " A , — -J 'Iа' у ' z' о' р ' »'NR,/ "NRAAJо ’ г' у' ct„1А'J''- .................i р о z у аIf^Фа г ^ 8 0Л ''R'ЛГ/ГразделениецепейА Тяжелая (Н) цепьА'/'а' у' z ‘ о' р ' Г_______________________________________________________ ^А'J'/ р о z у аN'R'В Тяжелая (Н) цепь(2) гибридизацияцепейАI (3) обработкануклеазойIР ’ °' 2 ' У‘ а 'i р........Чис тая Д Н Клактозного оперонао 2 у аРис. 12.5.
Выделение генов лактозного участка (lac-оперона) Е. coli (по J. Shapiro et al.,1969)Глава 12. Клеточная и генная инженерияФ 313Рис. 12.6. ДНК lac-оперона (J. Shapiro et al., 1969)А — результат гибридизации тяжелых цепей X и ф 80, содержащих комплементарныепоследовательности лактозного участка. Видны неспаренные одноцепочечные «хвосты»; Б — дуплекс генов /ас-оперона, освобожденный от неспаренных одноцепочечных«хвостов»этих бактериофагов тяжелую и легкую цепи можно разделить при помощи центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия.Если теперь взять только тяжелые цепи ДНК, то благодаря тому, что/яс-оперон был включен в геномы X и (р 80 в противоположных ориентациях, лишь один участок этих цепей будет иметь комплементарныепоследовательности оснований.
Это участок ДНК 1ас-оперона. Тогдапри гибридизации тяжелых цепей совершенный дуплекс получаетсятолько на участке 1ас-оперона, а остальные части цепочек останутсянеспаренными (рис. 12.6, А). Их удаляли действием нуклеазы, специфичной к однонитевой ДНК, и таким образом получили ДНК геновлактозного участка Е. coli в чистом виде (рис. 12.6, Б). ЭкспериментДж. Беквита и других принято считать началом генной инженерии.Поскольку остроумный подход к выделению 1ас-оперона тем не менеевесьма специфичен для бактерии Е.
coli, его сменили другие приемы,применимые в работе с любыми организмами.Главную роль на первом этапе выделения гена отводят эндонуклеазам рестрикции, или рестриктазам (см. гл. 10). Эти ферментыразрезают ДНК вблизи или внутри определенных последовательностей нуклеотидов (табл. 12.1), которые одинаковы на обеих комплементарных цепях. Два разрыва в одинаковых позициях комплементарных цепей на концах фрагмента образуют так называемые липкиеконцы, которые могут вновь объединяться благодаря комплементарности оснований. Последовательности, узнаваемые рестриктазами,314 *Часть 2.
Разнообразие и единство генетических механизмовТаблица 12.1Некоторые эндонуклеазы рестрикции - рестриктазы, образующие фрагментыс липкими концами (из В. И. Таняшина, 1979)ФерментУзнаваемый участок(5 ’ - 3 ’)Могут соединяться с фрагментами,образованными:Ava IQ PyC G PuGSal I, Xho I, Xma IBam HIGjGATTCBgl II, Mbo IBgl IIAjGATCTBam HI, Mbo IEco RIG |AATTCTasIAEco RIIjCC GGTTasIJ.AATTHae IIPuGCGCjPyH palG TTjAA CHind IIIA jA G C TTH in flGJ.ANTCНра IICjCG GMbo IjGATCPstICTGCAjGS a ilGjTCGACAva I, Xho ITaq ITJ.CGAH p a llXba ITJ.CTAGAXho ICjTCCAGA v a l, S a ilXma ICjCCGGGA va IEco RITaq IПримечание. Стрелки указывают точку разрыва; показана только одна цепь ДНК;Ри и Ру — любое пуриновое и пиримидиновое основание соответственно.
Названиерестриктазы образуют из первой буквы родового и двух первых букв видового названияпродуцента, добавляя к ним сокращенное наименование системы рестрикции, если впродуценте их несколько, или наименование нехромосомного элемента, кодирующегоданную рестриктазу. Например, Eco R1 — Е. coli с фактором RI или Hind III - Haemophilusinfluenzae, штамм d рестриктаза III.статистически разбросаны по геному. Чем короче последовательность, тем чаще она встречается и соответственно тем короче фрагменты ДНК, образующиеся при рестрикции.
Фрагменты рестрикции, или рестрикты, можно разделить по их молекулярной массе изаряду при помощи электрофореза в геле. Из различных микроорганизмов выделено множество рестриктаз с неодинаковой специфичГлава 12. Клеточная и генная инженерия#315ностью по отношению к нуклеотидным последовательностям ДНК.Отыскание нужного гена среди смеси рестрикционных фрагментовпредставляет известные сложности, о чем речь пойдет далее.Наряду с этим наиболее распространенным способом получениягенов существует также способ химического синтеза генов. Методология синтеза ДНК с заданной последовательностью нуклеотидовбыла разработана Г. Кораной в 60-х годах XX в., задолго до наступления эры генной инженерии.
После того как была расшифрована первичная структура первой индивидуальной нуклеиновой кислоты —аланиновой тРНК дрожжей, Г. Корана с сотрудниками синтезировалхимическим путем кодирующую часть гена для этой РНК размеромв 77 п. о. В дальнейшем — в 1976 г. в той же лаборатории был синтезирован ген тирозиновой тРНК Е. coli, который работал в клеткахкишечной палочки, будучи введенным в геном бактериофага Т4.Методология, разработанная Г. Кораной, широко применяется длясинтеза целых искусственных генов, например генов человеческогогормона инсулина, вводимых затем в бактериальные или дрожжевые клетки-продуценты.
В настоящее время существуют автоматыдля синтеза ДНК заданной последовательности. Те же подходы применяют для синтеза так называемых ДНК-зондов, т. е. небольшихучастков генов (20-30 п. о.). Это возможно, если известна хотя бычасть первичной структуры белка, кодируемого искомым геном. Тогда, пользуясь таблицей генетического кода (гл. 16), можно вывестиструктуру соответствующего участка гена.
Такие зонды используютдля поисков нужной комплементарной им иРНК, т. е. информационной РНК искомого гена (гл. 16).Выделенную при помощи зонда иРНК используют затем длясинтеза так называемой кДНК (комплементарной ДНК) с помощьюфермента обратной транскриптазы, о которой мы упоминали вглаве 11.Химический и энзиматический синтез генов имеет определенныепреимущества перед их поисками среди рестрикционных фрагментов. Тем не менее они имеют и недостатки, поскольку синтетическиегены чаще всего лишены ряда регуляторных элементов (гл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
