1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 61
Текст из файла (страница 61)
12.15. Исходная структура однонитевого вектора М13 со вставкой клонированнойДНК и олигонуклеотидом-затравкой, используемая при секвенировании по методуСэнгераА — пунктирная стрелка указывает направление последующего синтеза комплементарной нити. Б — продукты элонгации затравки в присутствии ddATP, останавливающегорост синтезируемой нити в точках, соответствующих А-аденинуэтом ДНК фрагментируют ультразвуком или с помощью рестриктаз,клонируют полученные случайным образом фрагменты в фаге М 13и определяют структуру всех этих фрагментов. Таким образом, секвенируют серию перекрывающихся нуклеотидных последовательностей и с помощью компьютера находят нуклеотидную последовательность исходного фрагмента ДНК.
Данный метод в некоторойстепени расточителен, так как обычно для выяснения структурыфрагмента длиной 1000 п. н. требуется секвенировать ДНК перекрывающихся фрагментов общей длиной гораздо большей, чем1000 п. н. Разработаны и более экономичные методы генерации серий делегированных вариантов длинной нуклеотидной последовательности, клонированной в фагах серии М13. В настоящее время332 *Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовсеквенирование проводят с помощью автоматических приборов —секвенаторов ДНК.12.10. Генная инженерия как «сумма технологий»*Генную инженерию, основанную на технике рекомбинантнойДНК, чаще всего ассоциируют с трансгенозом, т. е.
с переносом отдельных генов из генома одного вида организмов в геном другоговида. При этом не следует забывать, что генная инженерия расширила возможности молекулярно-генетического анализа отдельныхвидов. Мы уже рассмотрели методы векторной трансформации, применимые как к про-, так и к эукариотам, методы получения генов, ихрестрикционного анализа и секвенирования. Постепенно круг методов генной инженерии расширяется, открывая новые возможностидля анализа генома, протеома, транскриптома (см.
далее).Метод полимеразной цепной реакции, или PCR — от англ.Polymerase Chane Reaction — получил широкое распространение дляизбирательной амплификации конкретной нуклеотидной последовательности ДНК, а следовательно — индивидуальных генов. Методизобрел К. Маллис (К. Mullis), удостоенный за это открытие Нобелевской премии по химии в 1993 г.
Метод основан на использованиимеченого олигодезоксирибонуклеотида (20-30 нуклеотидов) с известной последовательностью оснований в качестве затравки (праймера) в реакции репликации ДНК in vitro (рис. 12.16). С геномнойДНК, расплавленной нагреванием до 98 °С, понижая температурудо 60 °С, гибридизуют однонитевой праймер, который спаривается скомплементарной последовательностью нуклеотидов. Затем при помощи ДНК-полимеразы праймер наращивается в направлении 5-3'.Полученные двуцепочечные молекулы вновь подвергают плавлениюпри высокой температуре, вновь гибридизуют с праймером, понижаятемпературу, и повторяют реакцию репликации. Повторяя подобныециклы амплификации ДНК, можно теоретически неограниченно увеличивать количество нужного фрагмента ДНК.
Существенную рольв этом методе играет использование термостойкой ДНК-полимеразыиз бактерии Thermus aquaticus, обитающей в горячих источниках.Этот фермент не инактивирует высокая температура.Сайт-направленный мутагенез в клонированном гене основанна тех же принципах, что и полимеразная цепная реакция. Зная нуклеотидную последовательность гена, можно изменять ее по собственному желанию. Подробнее см. главу 13."■«Сумма технологий» — название произведения С.
Лема, 1964.Глава 12. Клеточная и генная инженерияУДЛИНЕНИЕ ПРАЙМЕРОВ С ОБРАЗОВАНИЕМРАЗДЕЛЕНИЕ ЦЕПЕЙ ДНКИ ПРИСОЕДИНЕНИЕ ПРАЙМЕРОВ1-й циклКОПИИ ИЗУЧАЕМОГО ФРАГМЕНТА ДНКппптптЯ ШшппгттптпЯРЯДпппчпг.ПИ1П11ГтттттшъФ 333J11111111L1ТЛТТТП—->2-Й цикл 'ашпиДВВСШшжптпппт..ппшп1ШШШ■>5-Й ЦИКЛ 'xnmrSBBBtr iDiiiП 11ТГГГГГ~IIIIHIIHMiininmlll lllllll*JгДО БЕСКОНЕЧНОСТИПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ — это циклическийпроцесс; е к а ж д о м ц и к л * ч и с л о молекул ДНК-мивени удваивается. Цепи е каждом дуплексе ДНК-мишени разделяются при нагревании, потом при охлаждении с ними связываются праймеры.
Затем ДНК-полимераза наращивает праймеры присоединяя к ним нуклеотиды В результате образуются копии цепей исходной ДНК-мишениРис. 12.16. Полимеразная цепная реакция - PCR (По К. Маллису, 1990)Клонирование индивидуальных генов также позволяет проводитьслучайный мутагенез in vitro под действием физических, а преимущественно химических факторов, непосредственно взаимодействующих с ДНК или генетическим материалом в более широком смысле слова, в частности с хроматином.
Это открывает дополнительныевозможности для изучения молекулярных механизмов мутагенеза иразвития теории мутационного процесса.Развитие методов генной инженерии легло в основу не толькотакого мощного прикладного направления науки, как современная334 «Часть 2. Разнообразие и единство генетических механизмовбиотехнология, о чем мы уже упоминали, но и в основу новейшихфундаментальных направлений в биологии.
Среди последних необходимо назвать геномику (см. гл. 16), которая, основываясь наданных секвенирования геномов разных видов, анализирует структурные, функциональные и эволюционные закономерности их организации. Следует также назвать протеомику (см. гл. 16). Названиеэтого направления образовано от понятия протеом по аналогии сгеномом. Протеом представляет собой полный набор белков клеткии организма, их структуру, функции и взаимодействия.Двугибридная система для исследования взаимодействия белковв протеоме.
Многочисленные белки клетки функционируют, взаимодействуя между собой в надмолекулярных комплексах. Для изучениятаких взаимодействий широко используют метод, основанный на технике рекомбинантной ДНК, а также на знании механизма позитивнойрегуляции (активации) экспрессии генов (подробнее см. гл. 17).Белки, активирующие экспрессию генов, обычно содержат: домен, взаимодействующий со специфической последовательностьюДНК — UAS (от англ. Upstream Activating Sequence — активирующая последовательность перед геном) и активирующий домен, непосредственно отвечающий за активацию гена. Оба эти домена должныбыть пространственно сближены и физически взаимодействоватьдля активации какого-либо гена-репортера.Последовательности, кодирующие эти домены, разделяют.
Тучасть, которая кодирует первый домен (взаимодействующий с UAS),сливают с последовательностью ДНК, кодирующей исследуемыйбелок, взаимодействия которого необходимо выявить. Так конструируют плазмиду I, служащую своеобразным крючком с наживкой.Вторую часть, кодирующую активирующий домен, сливают с генами, кодирующими любые (в идеале все) белки клетки. Так конструируют набор плазмид II, предназначенных для «выуживания»последовательностей, кодирующих белки, которые взаимодействуют с исследуемым белком. Далее трансформируют клетки, обычно это клетки дрожжей, плазмидой I и набором плазмид II.
Крометого, клетки-реципиенты трансформации должны содержать генрепортер, экспрессия которого покажет, что взаимодействие произошло. При взаимодействии исследуемого белка (слитого с доменом,узнающим UAS) и какого-либо белка (слитого с активирующим доменом) оба домена оказываются сближенными и происходит активация и экспрессия гена, кодирующего белок-репортер.Это прямой метод исследования взаимодействий в протеоме.
Правда, он не свободен от артефактов, а именно псевдоположительных иГлава 12. Клеточная и генная инженерияАктивирующий335псевдоотрицательных результатов, когда специфичность взаиДНКсвязывающиймодействий доменов — активидоменUASiacLрующего и связывающего UASможет быть нарушена из-за объеБелок Xдинения этих доменов с другимибелками.
Дальнейшего уточненияUASlacLрезультатов достигают, применяя физико-химические методы непосредственного изученияБ ел ок Yвзаимодействий предполагаемыхбелков-партнеров как in vitro, таки in vivo (рис. 12.17).Итак, генная и клеточная инUASженерия возникла благодаря исlacZключениям, наблюдавшимся вРис. 12.17. Схема метода двугибриднойжизненных циклах ряда биолосистемы для выявления взаимодействиягических объектов.
Эти исклюбелковчения сами стали основными«правилами игры» в новой области. Широкое использование трансформации эукариот, элементыпарасексуального цикла в генетике эукариот, культивирование клеток многоклеточных организмов и т. д. объединяются в систему методов изменения генетического материала и создания организмов сновыми для них свойствами.Успехи генной инженерии в методах манипулирования генами наоснове рекомбинантных ДНК, получаемых in vitro, а также методыклеточной инженерии открывают огромные перспективы в экспериментальной биологии и в создании новых форм организмов, полезных человеку. Мощь этих методов поначалу испугала самих исследователей.
Вот как выразил это Э. Чаргафф в 1973 г.: «Имеем ли мыправо посягать необратимым образом на эволюционную мудростьмиллионов лет только для того, чтобы удовлетворить амбициюи любопытство нескольких ученых?» [Цит. по: Баев А. А. Общиепредставления о генетической инженерии. Итоги науки и техники.М., 1979. ВИНИТИ. Т. 12. Ч. 1. С. 7.] Прошел, однако, период первоговосхищения и растерянности. Генная и клеточная инженерия сталиповседневной рутиной научного эксперимента. Их используют дляселекции продуцентов полезных белков (см. гл. 24) и в медицинскихцелях (см. гл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
