1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 64
Текст из файла (страница 64)
и Дж. Ледерберг (рис. 13.2). Например, приизучении мутаций устойчивостиЕ.ты torf) клетки бактерии высевают на агаризованную среду в чашки Петри таким образом, чтобына них образовались отдельныеколонии. Затем при помощи бархатной печатки эти колонии перепечатывают на чашки с нанесенной суспензией частиц фага Т1.Рис. 13.2. Метод отпечатков для обнаружения мутантов у бактерий, устойчивых кБольшая часть клеток исходнойфагу Т1:(чувствительной) культуры (torf)не будет образовывать колоний,1 — получение отпечатка колоний напоскольку их лизирует бактериобархате; 2 — перепечатка на средуфаг.
Вырастут лишь отдельныес бактериофагами: 3 — инкубация отпечатка. Растущие колонии — черныемутантные колонии (torf), устойчивые к фагу. Сравнивая частотумутантов в контрольном и опытном (например, облученном ультрафиолетовым светом) вариантах, легко определить частоту индуцированных мутаций.Эксперимент можно выполнить проще: достаточно приготовитьсуспензию клеток Е. coli, разделить ее на две части, из которых однаконтрольная, а другую обрабатывают мутагеном. Обе суспензии высевают на среду без бактериофага — для подсчета числа жизнеспособных клеток, образующих колонии, и на среду с бактериофагом —для учета числа устойчивых клеток (рис.
13.3).В то же время метод отпечатков незаменим при учете мутантов,теряющих способность к росту на каком-либо субстрате, напримерауксотрофных по гистидину. Тогда колонии, выросшие на полноценной среде, перепечатывают на чашки со средой без гистидинаи отыскивают те, отпечатки которых на этой среде не способнык росту. Затем сравнивают их частоты в контрольном и опытномвариантах.Сложнее определить частоту спонтанного мутирования. Числомутантов, встреченных в контрольном варианте, обычно не отража-coliГлава 13.
Мутационный процесс. Генные мутации347Исходнаясуспензия Е. coliМутагенКонтрольбез бактериофагас бактериофагомСредаСредабез бактериофага с бактериофагомРис. 13.3. Учет частоты мутантов Е. coli, устойчивых к бактериофагу, методомпрямого рассевает непосредственно частоту мутирования, а лишь показывает концентрацию мутантов, которые могли некогда возникнуть и размножиться в культуре.
Как определить истинную частоту спонтанныхмутаций?Современные методы определения частоты спонтанного мутирования представляют собой модификации подхода, использованного С. Лурия и М. Дельбрюком (1942). Эти авторы впервые исследовали распределение числа мутантных клеток в параллельных348 ФЧасть 3. Изменчивостьклонах — бактериальных культурах. Рассмотрим один из вариантовопределения частоты спонтанного мутирования на конкретном примере исследования мутаций Ade ' —►Ade+ у мутанта по гену ADE2дрожжей-сахаромицетов.
Этот пример удобен тем, что колонии,образуемые исходной культурой, красные и нуждаются в аденине.Мутанты же (в данном случае — ревертанты) белые и в аденине ненуждаются. Это позволяет для выявления мутантов применять селективный метод.Прежде всего, нужно узнать распределение спонтанных мутантов среди клонов, содержащих одинаковое число клеток. В данномслучае удобнее всего использовать предложенный Н.
Н. ХромовымБорисовым метод упорядоченного посева на среде, полуобогащенной ограничивающим фактором роста.Капли равного объема из суспензии исходной культуры наносятспециальным репликатором на плотную среду, содержащую аденинв количестве необходимом для нескольких делений ауксотрофныхклеток ade2. Благодаря тому, что штыри репликатора (рис.
13.4, А,см. вклейку) расположены в углах правильной тригональной решетки, все колонии оказываются на равном расстоянии друг от другаи имеют одинаковый размер, а следовательно, и число клеток. Вариабельность не превышает 1 %. После прекращения роста колонийиз-за истощения аденина в среде на них появляются колонии вторичного роста, или «бородавки» мутантов Ade \ Они образуются врезультате продолжающихся делений мутантных клеток, не нуждающихся в аденине. Белые бородавки Ade+ хорошо заметны на фонекрасных колоний A de' (рис.
13.4, Б и В, см. вклейку).Тогда частоту мутаций (ш) в пересчете на клетку за одно клеточное деление вычисляют по формуле m = (X In 2)/N, где X — среднеечисло бородавок на одну колонию, N — среднее число клеток в колонии.Ту же задачу можно решить и другим способом. Поскольку спонтанные мутации — события редкие, распределение мутантов по колониямсоответствует распределению Пуассона. Если известна доля колоний,вообще не содержащих мутантов, Р0, то 1пР0= -X, где X — среднее число мутаций на колонию. Тогда, зная среднее число клеток в колонии(N), определим ш как и в предыдущем случае: m = (X In2)/N.Этот второй подход применим к вычислению частоты спонтанныхмутаций в параллельных жидких культурах, где мутантные клетки возникают, делятся и перемешиваются так, что непосредственно узнатьчисло независимых мутационных событий невозможно. В этом случае Р0 будет соответствовать доле параллельных культур, заложенныхГлава 13.
Мутационный процесс. Генные мутации349из одной суспензии и не содержащих мутантов. Естественное условиетакого эксперимента— отсутствие мутантов в исходной суспензииклеток. Определить частоту спонтанных мутаций можно и по распределению мутантных клеток между параллельными культурами,однако это требует более сложных вычислений. Частоты спонтанногомутирования у микрорганизмов представлены в таблице 13.1.Учет мутаций у дрозофилы. Изучение мутационного процесса,особенно спонтанного мутирования у высших организмов — растений и животных — затруднено в связи с ограниченным числомособей, которых можно исследовать, а также в связи с их диплоидностью, препятствующей непосредственному проявлению рецессивных мутаций.Наиболее удобные методы учета мутаций разработаны для дрозофилы (D. melanogaster).
Собственно именно создание метода учетарецессивных летальных мутаций в Х-хромосоме определило успехГ. Меллера, открывшего действие рентгеновых лучей на мутационный процесс у дрозофилы. Для учета рецессивных летальных мутаций, сцепленных с полом, у дрозофилы широко применяют методМеллер-5 (рис. 13.5). Самки линии Меллер-5, или М-5, несут в обеихХ-хромосомах по две инверсии: sc8 и S 49. Инверсия sc8 захватываетпочти всю Х-хромосому, а в ее пределах находится еще одна инверсия — д 49. В этой системе кроссинговер полностью подавлен.
Используемые инверсии не имеют рецессивного летального действия.Кроме того, обе хромосомы М-5 несут три маркера: два рецессивных — w° (абрикосовый цвет глаз) и sc8 (укороченные щетинки —фенотипическое проявление одноименной инверсии, затрагивающейген 5с) и один доминантный — Ваг.При скрещивании исследуемых самцов с самками М-5 в индивидуальных семьях F2 получают по два класса самок и самцов, если вХ-хромосоме сперматозоидов исходного самца не возникла рецессивная летальная мутация (рис. 13.5, А).
Если же рецессивная деталь появилась, то в соответствующей индивидуальной культуре вF2 м ы получим только один класс самцов (рис. 13.5, Б). Будут отсутствовать самцы дикого типа w+В+.Метод Меллер-5 можно использовать и для регистрации рецессивных мутаций в Х-хромосоме с видимым проявлением. Для этойцели удобнее применять метод double yellow, основанный на скрещивании исследуемых самцов с самками, несущими сцепленныеХ-хромосомы (см. гл.
7). Благодаря тому, что при таком скрещивании сыновья получают свою Х-хромосому непосредственно от отца,рецессивные мутации в этой хромосоме можно учитывать уже в Fl350 *Часть 3. ИзменчивостьТаблица 13.1Частота спонтанного мутирования некоторых генов у различных организмовОрганизм (признак)Бактериофаг Т2/ Круг хозяевПодавление лизисаEscherichia coliУстойчивость к1 стрептомицинуЗависимость отстрептомицинаЧувствительность к фагу Т1Устойчивость к фагу Т1Усвоение галактозыФерментация лактозыПотребность в гистидинеВосстановление прототрофности по гистидинуЧастотамутацийна геном загенерацию3 х 1091 х 10-*4 х 10-'°Организм (признак)Zea maysМорщинистые семенаПурпурные семенаСахарный эндоспермDrosophila melanogasterЧастотамутацийна геном загенерацию1х1 х К)-52х1 х 10-’Белые глаза4 х Ю52 х 10-8Желтое телоРасщепленные щетинки1 х ю-43 х 10-91 х Ю '02 х 10-72 х 10-*2хSalmonella typhimuriumВырезка на крылеКоричневые глазаMus musculusКоричневая окраска3 х 10-51,5 х3 х 10-58х3 х 10-5Альбинизм3 х Ю-sВосстановление прототрофности по триптофану5 х К)"8Пегость3 х ю -5Чувствительность кстрептомицину1 х К)-10Ослабленная окраска3 х ю -5Staphilococcus aureusЧувствительность ксульфатиазолуHomo sapiens1 х Ю-9Chlamydomonas reinhardtiiУстойчивость кстрептомицину1хNeurospora crassaАниридия — отсутствие радужной оболочки глаза5хРетинобластома (опухоль сетчатки)1 х Ю5Гемофилия А3 х Ю5Ахондроплазия (карликовость)4-8 х Ю-5Восстановление прототрофности по аденину4 х К)"8Нейрофиброматоз (опухоль нервной ткани)2хВосстановление прототрофности по инозиту8 х К)'8Альбинизм3 х 10-5Микроцефалия3 х 10-5Примечание.
Здесь понятие «генерация»соответствует репликации генома (одноделение) для клеток и вирусов и одному половому поколению для многоклеточных.Глава 13. Мутационный процесс. Генные мутацииw8ВIVеВwвВ351s9IFiIIVеВ№ВсvfВ$ $ \ w°B и w+B*;IVерХ-лучи/В3$IVеВw3Вiw3ВIIVеВIС1и/9ВVPВt|ЛЬмНupwaBnw+B;ВS S : WBРис. 13.5. Метод Меллер-5 для учета рецессивных, сцепленных с полом летальныхмутаций у D.
melanogaster. Рецессивная летальная мутация в кружкеА — отсутствует; Б — появилась352 *Часть 3. Изменчивость4747Рис. 13.6. Использование метода double yellow для учета рецессивных мутаций с видимым проявлением в Х-хромосоме в у дрозофилы(рис. 13.6). Учет летальных мутаций и мутаций с видимым фенотипическим проявлением легче удается для Х-хромосомы дрозофилыблагодаря специфике ее наследования.Существуют методы учета летальных мутаций в аутосомах. Например, для учета рецессивных летальных мутаций в хромосоме 2используют так называемый метод сбалансированных леталей. Дляэтого применяют линию, гетерозиготную по хромосоме 2.
В одномгомологе находятся доминантные гены Curly (Су — загнутые крылья) и Lobe (L — уменьшенные глаза лопастной формы), в другом гомологе — Plum (Рт — сливово-коричневый цвет глаз). Кроме того,хромосома Су L содержит инверсии, препятствующие кроссинговеру. Все три доминантные мутации обладают рецессивным летальным действием. Благодаря этому при разведении такой линии выживают только гетерозиготы по указанным генам. Это и есть системасбалансированных леталей.Для изучения рецессивных летальных мутаций, а также рецессивных мутаций с видимым проявлением исследуемых мухскрещивают с мухами Су L/Pm.
В F, получают мух, гетерозиготных по той или другой хромосоме исследуемой линии, и индивидуально вновь скрещивают сегрегантов Су L с мухами Су L/Рт. В F2 ( в индивидуальных культурах) скрещивают между собойсамцов и самок с признаками Су L и анализируют F3 (рис. 13.7).В отсутствие рецессивной летальной мутации расщепление в F3будет 2 Су L : 1 Су+L + (рис. 13.7, А), а если в половых клеткахмух исходной линии возникали летальные мутации, то в соответствующих индивидуальных культурах в F3 не будет нормальных353Глава 13. Мутационный процесс. Генные мутацииАСу___ LРтСуРтLСухFiLСуLРтLРтСуС у \ /LСуСуICyLACfVСу[РтLL тVСу/]L/LХ-лучиРтРт|СуLСуLFiРтС у \ /LСуL' СуLРтРтшЛ шСу1 \LСу&LС у^*■Су 7 ЧсСуL£2CyL: О С /ГРис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
